DNA损伤依赖性RIF1亚型转换调控DNA修复复合体组装与相分离的分子机制

《Journal of Biological Chemistry》：DNA-damage dependent isoform switching modulates RIF1 DNA repair complex assembly and phase separation

本研究揭示了DNA损伤通过调控RIF1基因第32号外显子(Ex32)的可变剪接，诱导产生长短两种RIF1亚型(RIF1-L/RIF1-S)的分子机制。研究人员发现SRSF1/SRSF3/SRSF7等剪接因子通过竞争性结合RIF1前体mRNA调控Ex32的纳入，且DNA损伤可促进RIF1-S的表达。蛋白质组学分析表明RIF1-L通过其特有的Ser/Lys富集结构域(S/K cassette)增强与MDC1的相互作用，并稳定CTD结构域的相分离能力，而CDK1介导的磷酸化则逆转这一过程。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，为理解RIF1在基因组稳定性维持中的功能多样性提供了新视角。

　　

在真核生物中，维持基因组稳定性是细胞生存的核心任务。RIF1（RAP1 interacting factor）作为一个多功能的核蛋白，在DNA双链断裂修复、复制时序调控和核结构组织等多个关键生物学过程中扮演着重要角色。然而，一个长期困扰科学家的问题是：RIF1如何能够同时协调如此多样化的功能？传统的解释聚焦于蛋白质的模块化结构以及翻译后修饰，但越来越多的证据表明，可变剪接可能是调控蛋白质功能多样性的重要机制。在这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究中，Adenine Si-Hui Koo等科学家深入探索了DNA损伤如何通过调控RIF1的可变剪接来影响其功能，揭示了这一过程在基因组稳定性维持中的新颖机制。

为了回答这些科学问题，研究人员采用了多种前沿技术方法。他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了RIF1-L特异性敲除的细胞系和小鼠模型；通过RNA干扰筛选和RNA免疫共沉淀技术鉴定调控RIF1剪接的关键因子；采用染色质免疫共沉淀结合质谱分析技术比较不同RIF1亚型的相互作用组；运用荧光漂白恢复技术和体外相分离实验研究RIF1 CTD结构域的相分离特性；同时分析了癌症基因组图谱数据库中多种癌症类型的RIF1剪接模式。

研究结果部分，科学家们取得了多项重要发现：

RIF1经历DNA损伤和细胞周期依赖的可变剪接

研究人员发现人类RIF1基因通过第32号外显子的选择性剪接产生RIF1-L和RIF1-S两种亚型，二者在C端结构域相差一个26个氨基酸的Ser/Lys富集结构域。暴露于放射性模拟药物Calicheamicin γ1或电离辐射后，细胞中RIF1-S的表达显著增加，表明DNA损伤能够抑制Ex32的纳入。这种剪接调控具有细胞周期依赖性，在G₂/M期RIF1-L表达最高，而在G₁期RIF1-S占主导。

RIF1亚型在癌症中的表达模式发生改变

通过对癌症基因组图谱数据的分析，研究人员发现与正常组织相比，乳腺癌、结肠腺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌中普遍存在RIF1-S表达上调而RIF1-L表达下调的现象，提示RIF1亚型转换可能与肿瘤发生发展相关。

点突变破坏Ex32纳入RIF1转录本

利用CRISPR/Cas9技术在RIF1 Ex32引入点突变，研究人员发现即使微小的插入缺失也能显著影响Ex32的剪接效率。在基因编辑小鼠模型中，Rif1基因Ex32区域的突变同样导致RIF1-L表达减少和RIF1-S表达增加，证实Ex32含有对剪接调控敏感的外显子剪接增强子元件。

鉴定RIF1剪接调控因子

通过siRNA筛选和验证实验，研究人员鉴定出SRSF1和snRNP70促进Ex32纳入，而PTBP1、SRSF3、SRSF7和RBM28抑制Ex32纳入。DNA损伤处理后，SRSF3和SRSF7与RIF1前体mRNA的结合增加，而SRSF1的结合减少，这种平衡变化可能是DNA损伤诱导Ex32跳读的分子基础。

DNA损伤诱导SRSF3和SRSF7与RIF1前体mRNA结合

进一步实验表明，DNA损伤不仅改变了剪接因子的表达水平，更重要的是改变了它们与RIF1转录本的结合模式。这种结合模式的变化为理解DNA损伤信号如何传导至剪接机器提供了直接证据。

RIF1亚型在DNA复制控制中表现相似

尽管在剪接调控和表达模式上存在差异，RIF1-L和RIF1-S在抑制MCM4过度磷酸化、调控DNA复制时序等经典功能上表现相似，表明这些基本功能不依赖于S/K结构域。

亚型蛋白质组学提示RIF1在基因组保护和DSB修复中的功能差异

通过染色质蛋白质组学分析，研究人员发现RIF1-L与MDC1的相互作用更强，并能更有效地促进MDC1在DNA损伤位点的聚集。相反，RIF1-S特异性地与NHEJ辅助因子PAXX相互作用。中性彗星实验显示RIF1-L表达细胞对电离辐射诱导的DNA损伤更具抵抗力，而RIF1-S表达细胞虽然初始损伤更严重，但修复速率更快。

CTD磷酸化减弱RIF1染色质和MDC1关联

研究人员发现S/K结构域中的S2260和S2265是CDK1的磷酸化位点，这些位点的磷酸化在 mitosis 期达到峰值。WEE1抑制剂处理可诱导这些位点的磷酸化，并减少RIF1与染色质的结合。磷酸化模拟突变体实验进一步证实，CTD结构域的多位点磷酸化通过增加蛋白质净负电荷来减弱其染色质结合能力。

S/K结构域调控RIF1相分离

通过生物信息学分析和实验验证，研究人员发现S/K结构域的存在降低了RIF1 CTD的结构无序性。GFP标记的RIF1 CTD在细胞核内形成动态的"各向异性小体"结构，表现出典型的相分离特征。RIF1-S CTD形成的各向异性小体更大、更易融合，而RIF1-L CTD形成的结构更稳定。磷酸化模拟突变会破坏相分离能力，而S/K结构域的存在可以部分抵抗这种破坏作用。

研究结论与讨论部分指出，这项研究系统阐明了DNA损伤通过调控RIF1可变剪接来实现功能多样化的新机制。DNA损伤和细胞周期信号通过改变SRSF1、SRSF3、SRSF7等剪接因子的表达和结合活性，动态调控RIF1-L和RIF1-S的表达平衡。两种亚型通过差异性的染色质结合能力、相分离特性和蛋白质相互作用网络，在基因组稳定性维持中发挥互补作用：RIF1-L通过增强MDC1聚集和形成稳定的相分离凝聚体，可能更适用于需要长期染色质关联的功能；而RIF1-S则可能通过其动态的相分离特性和与PAXX的相互作用，在快速DNA损伤应答中发挥作用。

该研究的创新性在于首次将DNA损伤信号、可变剪接调控和蛋白质相分离三个重要生物学过程联系起来，为理解DNA损伤应答的全新调控层面提供了重要见解。研究中发现的RIF1亚型在癌症中的表达改变，也为开发新的癌症生物标志物和治疗策略提供了潜在靶点。未来研究需要进一步阐明不同RIF1亚型在生理和病理条件下的具体功能，以及它们如何协同工作以确保基因组的完整性和稳定性。