菊粉基多聚体与核壳纳米粒的精准设计：靶向siRNA递送治疗结直肠癌的新策略

《Materials Today Advances》：Engineering a library of inulin based polyplexes and core-shell nanoparticles: Inside the targeted siRNA delivery to colorectal cancer cells

本研究针对siRNA递送面临的稳定性差、靶向性不足等挑战，设计并系统评估了一个由菊粉(INU)为基础、接枝支化聚乙烯亚胺(bPEI)、聚乳酸(PLA)和叶酸(FA)的接枝共聚物库。研究人员通过模块化策略合成了八种结构相关的共聚物，发现高bPEI密度反而会降低生物稳定性，而FA不仅能靶向结直肠癌(CRC)细胞，还能改善胶体与生物稳定性。与单纯多聚体(Px)相比，核壳纳米粒(NPs)能更好地保护siRNA并提高转染效率，尽管细胞摄取量较低。多组学分析证实了纳米系统的有效内化及细胞层面的安全性。该研究为基于多糖的下一代纳米载体的精细结构调控提供了新见解。

　　

在生物医学领域，利用RNA干扰（RNAi）技术，特别是短干扰RNA（siRNA），来治疗结直肠癌（CRC）等疾病，展现出巨大的潜力。siRNA能够精准地沉默与癌症进展相关的特定基因。然而，这些充满希望的“基因药物”本身非常脆弱，它们在体内面临着重重障碍：容易被酶降解、由于分子量大且带负电而难以穿过细胞膜、并且缺乏靶向特异性。因此，开发安全高效的递送系统，成为siRNA疗法能否成功应用于临床的关键前提。

为了克服这些挑战，科学家们常常使用带正电的聚合物作为载体，通过静电作用与带负电的siRNA结合，形成稳定的纳米复合物（即多聚体，Polyplexes，简称Px）。其中，支化聚乙烯亚胺（bPEI）因其独特的“质子海绵效应”——能在内吞体的酸性环境下缓冲pH变化，导致内吞体肿胀破裂，从而帮助siRNA逃逸到细胞质中——而被广泛应用。但单纯的bPEI系统也存在问题，比如表面正电荷过多可能引起毒性，以及缺乏主动靶向肿瘤的能力。传统的策略是使用聚乙二醇（PEG）进行修饰，以增加纳米颗粒的“隐形”特性，延长其在血液中的循环时间，但PEG的免疫原性风险促使人们寻找替代品。

在此背景下，意大利萨莱诺大学的研究团队将目光投向了一种天然多糖——菊粉（INU）。菊粉具有良好的生物相容性，有望作为PEG的替代品，为纳米载体提供亲水性和空间稳定性。本研究的核心创新在于，他们并非仅仅构建单一的递送系统，而是采用了一种系统性的“模块化”设计策略，从头开始构建了一个包含八种结构相关的菊粉基接枝共聚物的“库”。这个库的设计非常精巧：他们以天然菊粉为起点，首先通过控制氧化程度，在其骨架上引入不同数量的活性醛基；然后，通过还原胺化反应接枝不同密度的bPEI（形成INU-bPEI），以提供结合siRNA的正电荷和促进内吞体逃逸的缓冲能力；接着，引入疏水性的聚乳酸（PLA）片段（形成INU-bPEI-PLA），使共聚物具有两亲性，能够在水溶液中自组装形成更稳定的核壳结构纳米粒（Nanoparticles， NPs），其内部是PLA构成的疏水核心，外部是亲水的INU-bPEI壳层；最后，为了实现对结直肠癌细胞的主动靶向，他们还将叶酸（FA）作为靶向分子偶联到共聚物上（形成INU-bPEI-FA和INU-bPEI-PLA-FA），因为叶酸受体在包括CRC在内的多种癌细胞表面过度表达。

这种循序渐进的构建方法，使得研究人员能够像搭积木一样，系统地研究bPEI接枝密度、PLA引入带来的两亲性、以及FA靶向修饰这三个关键变量，如何共同影响最终纳米颗粒的形成、稳定性、生物相容性以及siRNA的递送效率。他们发现了一些反直觉的现象，例如高密度的bPEI反而对生物稳定性有负面影响，而FA除了经典的靶向功能外，还出人意料地改善了纳米系统的胶体和生物稳定性。这项意义深远的研究成果发表在材料科学领域的知名期刊《Materials Today Advances》上。

为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先是模块化的化学合成与表征：他们通过氧化、还原胺化、缩合等化学反应，逐步构建共聚物库，并利用核磁共振氢谱（¹H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、凝胶渗透色谱（GPC）和差示扫描量热法（DSC）等手段对产物进行化学结构、分子量和热性能表征。其次，他们系统评估了纳米系统的技术性能：通过动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）分析siRNA负载纳米颗粒（包括多聚体Px和核壳纳米粒NPs）的粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位；通过琼脂糖凝胶电泳评估siRNA结合能力、抗核酸酶降解能力和在血清白蛋白存在下的稳定性；通过透析法研究siRNA的体外释放动力学。再者，研究包含了全面的生物学评价：使用小鼠结肠腺癌细胞系MC38（样本来源为NCI，并由比利时VIB-KU Leuven的Max Mazzone教授惠赠）进行体外细胞毒性（MTT法）、细胞增殖（活细胞分析）和转染效率评估；通过荧光显微镜和流式细胞术分析FA靶向纳米系统的细胞摄取及其机制（竞争抑制实验）；最后，研究还采用了先进的多组学分析技术：对经纳米颗粒处理的细胞进行联合提取，然后分别利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进行蛋白质组学、代谢组学和脂质组学分析，以在分子水平上深入探究细胞的响应。

3.1. 菊粉基聚阳离子库的设计与合成

研究人员成功设计并合成了一个包含八种菊粉衍生物的库。合成路径从菊粉（INU）的氧化开始，生成带有醛基的氧化菊粉（INU-OX）。然后通过还原胺化反应将bPEI接枝到INU-OX上，得到了两种不同bPEI接枝密度（DD_bPEI mol% 约为7%和15%）的产物INU-bPEI₂和INU-bPEI₄。接着，通过EDC/NHS缩合反应将PLA链段连接到INU-bPEI上，得到了两亲性的INU-bPEI-PLA共聚物。最后，同样利用缩合反应将叶酸（FA）靶向分子分别连接到INU-bPEI和INU-bPEI-PLA上，最终完成了整个库的构建。对共聚物的表征（GPC, DSC）证实了成功合成，并且两亲性共聚物的临界聚集浓度（CAC）值较低，预示着其自组装纳米粒在体内具有较好的稳定性。

3.2. siRNA复合与胶体行为

研究表明，亲水性的INU-bPEI系列与siRNA通过静电作用形成多聚体（Px），而两亲性的INU-bPEI-PLA系列则通过自组装形成核壳纳米粒（NPs）。琼脂糖凝胶电泳和DLS分析表明，复合物的形成能力和最小聚合物/siRNA重量比（R）与bPEI的电荷密度相关。FA的引入对Px的尺寸影响不大，但使NPs尺寸略有增加。胶体稳定性测试发现，FA功能化的纳米系统（t-IP2, t-IP2P）在不同介质中均表现稳定，提示FA具有稳定作用。缓冲能力测定揭示了一个意外发现：bPEI接枝密度较低的衍生物（INU-bPEI₂系列）反而表现出比高密度系列（INU-bPEI₄）更好的缓冲能力，且FA的引入进一步增强了缓冲容量，这可能有利于内吞体逃逸。通过比较扫描电镜（SEM）和DLS测量的尺寸，发现Px在水合状态下体积膨胀远大于NPs，表明Px具有更强的溶胀能力。

3.3. 体外siRNA释放

siRNA释放研究表明，所有纳米系统均能实现siRNA的持续释放。具有较高bPEI电荷密度的复合物（IP4, IP4P）对siRNA的保留能力更强，释放更慢。出乎意料的是，与NPs相比，溶胀性更强的Px显示出更慢的释放动力学，这可能与其高度水化的网络结构增强了与siRNA的相互作用和空间位阻有关。释放数据最好地用Korsmeyer-Peppas和Weibull模型拟合，表明释放机制是扩散控制的。

3.4. 聚阴离子竞争实验

通过考察人血清白蛋白对复合物的影响，评估了纳米载体在生物环境中的稳定性。结果显示，对于bPEI2系列和所有靶向纳米系统，即使在最低复合比例下，siRNA也不会被白蛋白置换出来，表明复合物非常稳定。然而，对于IP4和IP4P，在最低R值下观察到了siRNA的置换，提示高bPEI密度可能对复合物稳定性产生负面影响，而FA的引入似乎能在一定程度上缓解这种效应。

3.5. RNA酶保护实验

该实验评估了共聚物保护siRNA免受核酸酶降解的能力。除了IP4P在最小R值（R3）下未能提供保护外，其他纳米系统在达到完全复合siRNA所需的最小R值时，均能有效保护siRNA。在低于最小R值的条件下，IP2等部分系统仍能保护已复合的siRNA fraction，而IP4则不能。FA的偶联恢复了bPEI4系列成员在亚复合比例下保护siRNA的能力。

3.6. 体外血液相容性

通过血红蛋白释放实验评估了共聚物的血液毒性。结果表明，INU-bPEI和INU-bPEI-PLA共聚物在25–100 μg/mL浓度范围内具有良好的血液相容性。特别值得注意的是，FA功能化的衍生物在更高浓度下（对于-bPEI₄系列可达500 μg/mL，对于-bPEI₂系列可达1000 μg/mL）仍保持很高的血液相容性，表明FA修饰能显著改善材料的生物相容性。

3.7. 有机溶剂去除与复合

研究表明，用于制备NPs的有机溶剂DMF可以通过透析有效去除，并且冻干后的纳米粒在重新水化后，仍能保持与siRNA的高效复合能力，这为纳米制剂的实际储存和应用提供了便利。

3.8. 增殖实验

初步细胞增殖实验表明，在所用浓度范围内，未靶向的共聚物本身对MC38细胞的增殖没有明显影响。但观察到INU-bPEI₄和INU-bPEI₄-PLA在高浓度下会在含血清的培养液中形成大的聚集体，干扰检测。后续细胞实验改在无血清的OPTIMEM培养基中进行。

3.9. 体外转染研究

使用细胞毒性siRNA（siTOX）评估转染效率。结果显示，无论是未靶向还是靶向的纳米系统，在很低的重量比（R1）下就能引起细胞存活率的显著下降，表明有效的siRNA递送和基因沉默。其中，FA靶向的NPs（t-IP2P和t-IP4P）效果最为显著。有趣的是，虽然Px的细胞摄取量更高，但NPs却表现出同等甚至更好的转染效率，这表明NPs可能具有更优的细胞内运输和siRNA释放机制。

3.10. 细胞摄取

通过荧光显微镜和流式细胞术分析FA靶向纳米系统对Cy5标记siRNA的摄取。结果显示，摄取是时间依赖性的，并且在6小时达到最大。流式细胞术定量表明，靶向Px（t-IP2, t-IP4）的摄取率（~99%, 98%）远高于对应的靶向NPs（t-IP2P, t-IP4P；74%, 18%）。竞争实验（加入游离FA）显著抑制了摄取，证实了摄取是通过叶酸受体α（FRα）介导的内吞作用实现的。这一发现与转染实验结果形成对比，再次提示NPs虽然摄取量低，但其内在性质（如更好的siRNA保护、更有效的内吞体逃逸）使其转染效率更高。

3.11. 纳米粒细胞响应的多组学评估

对经siLUC负载的t-IP2P NPs处理的MC38细胞进行多组学分析，从更深层次揭示了细胞反应。蛋白质组学发现，与对照组相比，NPs处理组的蛋白质表达谱发生显著改变。上调的蛋白质富集在与膜、细胞骨架、微管和马达活性相关的通路，提示细胞为应对纳米颗粒的内化而发生了主动的细胞骨架重组和囊泡运输增强，这可能有利于纳米颗粒的内吞体逃逸。下调的蛋白质则主要集中在核糖体蛋白和mRNA加工运输相关因子，这可能是细胞在纳米颗粒应激下的一种适应性反应或暂时性的翻译抑制。代谢组学发现氨基酸水平升高，可能与翻译过程减缓有关；乳酸增加则提示糖酵解可能被增强。脂质组学显示多种膜脂（如溶血磷脂酰胆碱LPCs、鞘磷脂SMs等）下调，反映了纳米颗粒进入后对细胞膜结构和功能的深刻影响。多组学数据整体表明，t-IP2P NPs引发了积极的细胞摄取和相应的分子层面适应，同时未引起严重的细胞毒性，支持了该纳米系统的有效性和生物安全性。

综上所述，本研究通过精巧的模块化设计，成功构建了一个菊粉基的 siRNA 递送载体库，并系统地揭示了其结构（bPEI密度、PLA疏水链、FA靶向基团）与功能（纳米特性、稳定性、生物相容性、转染效率）之间的复杂关系。研究不仅证实了引入PLA疏水核心形成核壳纳米粒（NPs）在改善siRNA保护和递送效率方面的优势，还发现了FA功能化所带来的超越靶向的稳定化效应，以及一些反直觉的结构-功能关系（如高bPEI密度对稳定性的潜在负面影响）。多组学分析为纳米载体与细胞相互作用的机制提供了新颖且深入的见解，证实了其安全性。

这项研究的重要意义在于，它为合理设计基于天然多糖的下一代纳米载体提供了宝贵的指导原则和实验依据。所开发的平台不仅适用于siRNA的靶向递送，其两亲性核壳结构还预留了共载送疏水性化疗药物的潜力，为未来开发针对结直肠癌等实体瘤的协同联合疗法奠定了坚实的基础。尽管研究存在一些局限性，如载体分子的均一性控制、体外模型的局限性等，但其系统性的研究策略和深入的机制探讨，无疑将推动非病毒基因递送系统向更安全、更高效、更智能的方向发展。