DNA逻辑探针的“与”和“或”运算：基于双microRNA在复杂环境中荧光检测鉴别卵巢癌细胞

《Materials Today Bio》：“AND” or “OR” Logic Operations of DNA Probes: Fluorescent Detection and Discrimination of Ovarian Cancer Cells via Dual-microRNA in Complex Environments

本研究针对卵巢癌单靶标检测特异性不足、信号延迟等问题，构建了基于“AND”和“OR”逻辑运算的双miRNA检测系统。通过发夹结构介导的miRNA循环放大机制，实现了对SKOV3细胞中miR-221和miR-96的高灵敏、高特异性检测，为卵巢癌的智能便携式生物传感提供了新平台。

　　

卵巢癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，对女性健康构成严重威胁。由于其发病机制复杂、早期症状不明确且预后相对较差，卵巢癌的早期诊断一直是一个重大挑战。因此，早期快速检测特异性生物标志物对于提高诊断准确性至关重要。在众多生物标志物中，microRNA（miRNA）作为内源性的非编码小RNA分子，在调控基因表达、细胞分化和凋亡中扮演关键角色。某些miRNA的异常表达和失调能够调节与其他靶基因相关的信号通路，从而影响疾病进展。例如，miR-221和miR-96在卵巢癌细胞系中均呈现高表达，与肿瘤的发生发展密切相关。

然而，现有的检测技术大多聚焦于单个卵巢癌细胞中单一miRNA的检测。由于灵敏度和特异性有限，依赖单一生物标志物进行卵巢癌检测效果不佳，尤其是在复杂的生物环境中，单miRNA检测可能导致实际应用受限和假阳性风险增加。因此，同时检测多个miRNA有望提升临床适用性。

逻辑门电路能够处理和中继数字信号，其精密设计在复杂生物环境中检测和分析多个生物标志物方面发挥着至关重要的作用。DNA作为细胞中常见的生物分子，具有优异的生物相容性、特异性和可编程性，因此可以被设计成各种形式的信号载体，并巧妙应用于生物传感领域。尽管DNA逻辑门技术相对成熟，但其在卵巢癌多靶标检测中的应用尚未完全整合。为此，迫切需要开发一种基于DNA逻辑运算的双靶标microRNA检测平台，能够准确识别卵巢癌细胞并促进潜在的临床应用。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，研究人员设计了一种DNA逻辑电路，用于检测SKOV3细胞中的两种miRNA：miR-221和miR-96。该电路包含一个可同时检测两种miRNA的“AND”门和一个可独立检测两种miRNA的“OR”门。研究的核心创新在于发夹结构介导的miRNA循环机制，通过竞争性结合使靶分子能够反复参与反应，从而放大信号效率。

为开展此项研究，研究人员主要应用了几项关键技术方法。首先，他们设计并组装了用于“AND”和“OR”逻辑运算的DNA探针及发夹结构（如AH1、H3、BH2等），并通过NUPACK软件对预设的DNA链进行了结构预测分析。其次，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了DNA逻辑电路的可行性及其与靶标miRNA的反应过程。第三，通过荧光光谱法评估了逻辑电路对不同浓度miRNA的响应，并计算了检测限。第四，将DNA探针通过脂质体转染导入SKOV3、A549、HeLa等多种细胞系，并使用共聚焦激光扫描显微镜进行细胞内荧光成像分析，以验证逻辑电路在活细胞中的运算功能。最后，在SKOV3和OVCAR-3卵巢癌荷瘤裸鼠模型中进行了体内荧光成像实验，评估了该检测系统在活体层面的应用潜力及生物安全性。研究未涉及大规模临床样本队列，主要使用标准细胞系和荷瘤小鼠模型。

3.1. AND逻辑电路和OR逻辑电路的设计

在AND逻辑电路中，检测探针由1链、3-1链和4-1链预组装而成，并与AH1和H3一同瞬时递送入细胞。当DNA探针进入细胞质后，miR-221首先与3-1链结合，同时3-1链从4-1链上解离，释放Cy3荧光并暴露miR-96的反应位点。随后，miR-96取代1链并与4-1链结合，显示Cy5荧光。为了应对细胞内miRNA丰度低的问题，研究人员额外设计了两个发夹结构用于释放miRNA回收到循环中，以增强细胞内荧光成像。OR逻辑电路中的DP2则由1链、2链、3链和4链组成，两侧为对称结构。因此，对miR-221和miR-96的检测互不干扰，并产生一对一的输出信号。

3.2. DNA逻辑电路的可行性分析

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了DNA单链及组装产物的正确性。在AND逻辑电路中，只有当miR-221和miR-96同时存在时，才能观察到1链的释放，完成整个反应通路。而在OR逻辑电路中，任意一种miRNA的存在均可导致相应链的置换和荧光信号的产生。荧光动力学实验表明，两种逻辑电路的荧光信号在反应20分钟后均达到最大。荧光光谱分析显示，荧光信号随miRNA浓度的增加而增强。根据3σ原则计算，AND系统中miR-221和miR-96的检测限分别为0.1792 nM和0.1990 nM，OR系统中的检测限分别为0.1020 nM和0.056 nM，表明该系统具有一定的检测潜力。

3.3. 生物安全性分析和qRT-PCR

通过Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分析证实，DNA探针具有良好的生物相容性，细胞存活率超过90%。采用一步法RT-qPCR SYBR Green试剂盒验证了不同细胞中miR-221和miR-96的基础表达水平，结果显示在SKOV3细胞中的相对表达量远高于正常HOSE-B细胞。

3.4. 双输入逻辑电路的选择性

研究通过设置不同的输入组合（如仅miR-221、仅miR-96、两者皆有、以及其他干扰miRNA如miR-21和miR-155），验证了逻辑电路运算的正确性。共聚焦荧光成像和流式细胞术结果均与真值表预期一致。例如，在AND电路中，只有当两种miRNA共存时才有Cy5信号输出；而在OR电路中，任一miRNA的存在即可触发相应的荧光信号。此外，研究还通过使用miRNA抑制剂，在细胞内模拟了不同的输入条件，进一步证实了逻辑电路在活细胞环境中的选择性。该探针系统还通过替换互补序列，成功应用于MCF-7、HeLa和4T1细胞中其他miRNA组合（如miR-21/miR-155）的检测，展示了其良好的可编程性和通用性。

3.5. 利用DNA逻辑电路在体内识别特异性肿瘤细胞

体内成像实验表明，将“AND”和“OR”检测系统注射到SKOV3或OVCAR-3荷瘤裸鼠体内后，肿瘤部位的荧光强度在注射后3小时达到峰值，且显著高于其他正常组织。离体器官成像和苏木精-伊红染色结果显示，重要器官未见明显病变，肿瘤组织中有残留荧光信号，部分通过肝肾代谢，证明了该DNA探针在体内的生物安全性和有效检测能力。

综上所述，本研究成功将DNA逻辑门技术与卵巢癌中高表达的miRNA相结合，构建了“AND”和“OR”两种检测模式，能够准确识别卵巢癌细胞中的特异性miRNA。发夹结构的引入显著增强了输出信号，这对于细胞内miRNA检测的实际应用至关重要。该DNA逻辑检测系统通过选择性检测miRNA特异性，解决了miRNA相似性高的挑战。此外，由于逻辑模块的可编程性和易操作性，其设计原理可以灵活应用于其他细胞和临床场景。该系统能够同时检测卵巢癌细胞中的两种miRNA并放大检测信号，因此在癌细胞类型识别和未来临床应用中具有重要潜力。这项工作为智能、便携式生物传感和生物分析应用提供了新的视角。