靶向铜绿假单胞菌的介孔金纳米棒纳米发生器：近红外激光触发烷基自由基生成用于增强细菌性伤口治疗

针对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染的高发病率和抗生素耐药性难题，研究人员开发了一种新型的靶向性纳米发生器mGNR@AIPH@PEG-Mal。该研究利用介孔金纳米棒（mGNR）作为载体负载烷基自由基（AR）引发剂AIPH，并通过马来酰亚胺（Mal）功能化实现对细菌IV型菌毛（T4P）的特异性靶向。在808 nm近红外（NIR）激光照射下，纳米发生器产生温和光热治疗（MPTT）效应并触发AIPH裂解释放大量AR，通过协同MPTT/AR作用高效杀灭铜绿假单胞菌及其生物膜，显著促进感染伤口的愈合。该研究为克服缺氧微环境下的抗菌治疗提供了新策略，具有重要的临床转化潜力。

　　

在当今的医疗保健领域，由细菌感染引起的慢性伤口，尤其是那些由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa）引发的感染，构成了一个严峻的挑战。世界卫生组织（WHO）已将铜绿假单胞菌列为“优先级1：关键”病原体，这归因于其高发病率、高死亡率以及对一线和二线抗生素的耐药性。这种细菌在全球范围内造成了约10%–11%的医院获得性感染。目前的治疗策略，如全身性抗生素（如头孢他啶、粘菌素）和局部消毒剂，常常因为生物膜介导的耐受性（敏感性降低高达1000倍）和日益增长的耐药性而失败。约80%的病例会出现复发感染，这凸显了传统疗法的局限性。因此，迫切需要开发新的抗菌策略来高效治疗与铜绿假单胞菌相关的伤口感染。

传统的光动力疗法（PDT）利用特定波长的激光激活光敏剂产生细胞毒性的活性氧（ROS），在根除浅表细菌感染方面显示出效果。然而，传统PDT的一个明显缺点是ROS的产生强烈依赖于氧气，而在慢性伤口等缺氧微环境中，其治疗效果会大大减弱。近年来，烷基自由基（Alkyl Radical, AR）作为一种可以在不依赖氧气水平的情况下产生的自由基，在许多生物医学应用中引起了广泛关注。与需要氧气的PDT相比，AR具有独特的优势。然而，目前大多数AR相关研究主要集中在抗癌应用上，探索AR在抗菌应用中的研究仍然有限。更重要的是，能够精确控制在细菌感染部位释放AR的靶向递送系统尚未开发出来。

靶向递送被认为是治疗细菌感染的有效方法。通常，纳米系统会被功能化，例如连接抗体、适配体或细菌特异性分子，以精确识别细菌表面标志物，从而提高其递送效率并最大限度地减少对宿主细胞的脱靶毒性。铜绿假单胞菌表面的IV型菌毛（Type IV Pilus, T4P）是一种聚合物蛋白纳米纤维，在细菌粘附、运动和生物膜形成中起着重要作用。最近的研究表明，马来酰亚胺（Maleimide, Mal）可以特异性靶向并结合T4P，从而减少铜绿假单胞菌的运动。这为开发针对铜绿假单胞菌感染的靶向AR递送系统提供了新的思路。

在此背景下，研究人员在《Materials Today Bio》上发表了一项研究，报道了一种新型的多功能纳米发生器——mGNR@AIPH@PEG-Mal。该研究旨在解决铜绿假单胞菌感染治疗中的靶向性差和缺氧微环境疗效不佳的难题。研究人员首先合成了具有温和光热治疗（Mild Photothermal Therapeutic, MPTT）效果的介孔金纳米棒（mesoporous Gold Nanorod, mGNR），并将其作为载体，有效负载AR引发剂2, 2′-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]-dihydrochloride (AIPH)。然后，依次加入半胱胺和聚合物HOOC-PEG₅₀₀₀-Mal对纳米系统进行功能化，最终得到纳米发生器mGNR@AIPH@PEG-Mal。由于马来酰亚胺与T4P的特异性反应，该纳米发生器对铜绿假单胞菌表现出高结合效率。在近红外（NIR）激光照射下，mGNR@AIPH@PEG-Mal触发AIPH裂解，产生大量AR，通过协同的MPTT/AR抗菌效应，实现对铜绿假单胞菌和生物膜的高效抑制。此外，该纳米发生器在铜绿假单胞菌感染的大鼠伤口模型中表现出优异的抗菌和伤口愈合效果。

为开展此项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先，通过种子介导法合成介孔金纳米棒（mGNR）作为核心载体；其次，采用化学偶联法将AIPH负载到mGNR上，并进一步功能化半胱胺和HOOC-PEG₅₀₀₀-Mal聚合物，构建靶向纳米系统；利用紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、Zeta电位和动态光散射（DLS）等技术对纳米材料进行表征；通过近红外热成像评估其光热效应；使用ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）探针和电子顺磁共振（ESR）光谱检测烷基自由基的生成；通过菌落计数法、SYTO-9/PI双荧光染色和结晶紫染色评估体外抗菌和抗生物膜效果；利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、扫描电子显微镜（SEM）和生化方法（如GSH检测、TUNEL染色、ROS检测）深入探究抗菌机制；最后，在大鼠铜绿假单胞菌感染的全层皮肤伤口模型中，通过细菌载量监测、伤口愈合面积测量、组织学分析（H&E和Masson染色）以及免疫荧光/免疫组化染色（检测CD86、CD206、IL-6、iNOS、TNF-α、CD31、α-SMA等指标）评估体内治疗效果、伤口愈合情况和免疫调节作用。实验动物为从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的雌性Sprague-Dawley大鼠。

3.1. 纳米发生器mGNR@AIPH@PEG-Mal的合成与表征

研究人员成功合成了一种具有特异性铜绿假单胞菌靶向和NIR激光控制AR释放特性的多功能纳米发生器mGNR@AIPH@PEG-Mal。首先，通过改进的种子介导合成法制备了介孔金纳米棒（mGNR），作为有效负载AIPH的载体，从而制备出mGNR@AIPH。随后，将半胱胺功能化在mGNR@AIPH表面，并通过酰胺键与末端为羧基和马来酰亚胺基的双功能PEG聚合物（HOOC-PEG₅₀₀₀-Mal）连接，获得靶向纳米发生器。表征结果显示，mGNR在600-900 nm波长范围内有宽吸收峰，表明其在NIR区域具有强局部表面等离子体共振（LSPR）效应，这赋予了其优异的光热性能。mGNR@AIPH@PEG-Mal的UV-Vis光谱中在364 nm处出现了AIPH的特征峰，证实了AIPH的成功负载，负载效率为27.68%。Zeta电位、流体动力学直径（D_h）和FTIR测量结果均证实了纳米发生器的成功制备。光热效应评估表明，mGNR@AIPH@PEG-Mal在808 nm激光照射下表现出浓度和功率密度依赖的温度升高，在1 W/cm²激光照射下（材料浓度160 μg/mL），5分钟内温度可升至46.2 °C，显示出用于MPTT的潜力，并且经过4次“加热-冷却”循环后光热稳定性良好。使用ABTS探针和ESR光谱证实了NIR激光可触发AIPH裂解并可控释放AR，间歇性激光照射可在60分钟内实现82.4%的AR释放率。

3.2. 纳米发生器的体外铜绿假单胞菌靶向及抗菌效果

研究表明，由于马来酰亚胺功能化，mGNR@AIPH@PEG-Mal对铜绿假单胞菌表现出高靶向能力。共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术结果显示，罗丹明B标记的RB-PEG-Mal能高效且时间依赖性地被铜绿假单胞菌摄取，而对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的摄取则很弱。透射电子显微镜（TEM）也显示大量纳米发生器附着在铜绿假单胞菌膜表面。体外抗菌评价显示，mGNR@AIPH@PEG-Mal在NIR激光照射下，通过协同MPTT/AR抗菌效应，几乎能完全消除铜绿假单胞菌菌落，其效果显著优于单独MPTT或AR处理组。相比之下，该纳米发生器对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌的抗菌效果较弱，证明了其对铜绿假单胞菌的特异性杀伤效率。

3.3. 纳米发生器的体外协同MPTT/AR抗生物膜效果

通过SYTO-9/PI双荧光染色和结晶紫染色评估了纳米发生器的抗生物膜能力。CLSM三维图像显示，mGNR@AIPH@PEG-Mal + NIR处理能最有效地根除预形成的铜绿假单胞菌生物膜，清除率达95%。结晶紫染色结果也表明，该处理组残留的生物膜生物量最少。此外，纳米发生器的抗生物膜活性呈现浓度依赖性，在200 μg/mL浓度下可实现近乎完全的生物膜根除。

3.4. 协同MPTT/AR抗菌机制探究

研究人员深入探讨了协同抗菌机制。SYTO-9/PI染色和SEM观察发现，mGNR@AIPH@PEG-Mal + NIR处理导致最严重的细菌膜损伤，菌体变形、表面粗糙破裂。该处理还导致上清液OD₂₆₀值最高，表明细胞内成分泄漏最多。通过DCFH-DA探针检测发现，协同处理触发了最高的细胞内ROS水平升高。进一步使用特异性探针证实了超氧阴离子（O₂^•-）、单线态氧（¹O₂）和羟基自由基（•OH）的生成均显著增强。细胞内ROS爆发导致抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）被大量消耗，ThiolTrace Violet 500荧光探针检测显示协同处理组细胞内GSH几乎完全耗竭。最终，DNA损伤检测（TUNEL染色）表明，由于ROS水平升高和GSH保护作用丧失，细菌DNA遭到严重破坏。综上所述，协同MPTT/AR抗菌机制是通过破坏细菌膜、触发ROS爆发、耗竭GSH和损伤DNA，最终导致铜绿假单胞菌死亡。

3.5. 纳米发生器在伤口感染模型中的体内协同治疗效果

在铜绿假单胞菌感染的大鼠全层皮肤伤口模型中评估了体内疗效。近红外热成像显示，得益于其靶向性，mGNR@AIPH@PEG-Mal + NIR处理使伤口温度在5分钟激光照射下升至46°C，体现了体内MPTT效应。体内抗菌评价表明，该协同治疗能最有效地减少伤口部位的细菌载量。同时，它能显著加速伤口愈合，在第10天几乎实现伤口完全闭合，效果远优于对照组及单独治疗组。组织学分析（H&E和Masson染色）显示，协同治疗组表皮缺损面积最小，炎症中性粒细胞浸润最少，胶原沉积水平最高，表明其具有优异的抗炎和促进组织修复能力。

3.6. 体内伤口愈合机制及生物相容性评价

对体内伤口愈合机制的深入研究表明，铜绿假单胞菌感染会引发严重的炎症风暴并使巨噬细胞极化为促炎的M1型，形成免疫抑制环境，阻碍愈合。免疫荧光染色显示，mGNR@AIPH@PEG-Mal + NIR处理能显著降低M1型标志物CD86的表达，同时提高M2型标志物CD206的表达，表明其能通过诱导M2型巨噬细胞复极化来逆转免疫抑制环境。此外，该处理还显著降低了炎症因子IL-6、iNOS和TNF-α的表达，表现出优异的抗炎效果。血液生化指标分析也证实炎症相关指标（WBC, LY, NEUT）恢复至健康大鼠水平。免疫荧光染色进一步显示，协同治疗促进了伤口组织中血管生成标志物CD31和α-SMA的高表达，表明其通过促进新生血管形成来加速愈合。生物相容性评价显示，纳米发生器对小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）具有高细胞相容性。大鼠主要器官的H&E染色未发现明显组织学病变，血液生化指标正常，体重稳步增加，证明其具有良好的体内生物相容性和安全性。

该研究成功设计并构建了多功能纳米发生器mGNR@AIPH@PEG-Mal。由于其表面的马来酰亚胺基团功能化，该纳米发生器能通过结合细菌T4P，对铜绿假单胞菌表现出高度特异性的靶向能力。在NIR激光照射下，纳米发生器产生协同的MPTT/AR抗菌效应，有效抑制铜绿假单胞菌并根除其生物膜。更重要的是，该纳米发生器在治疗铜绿假单胞菌伤口感染方面表现出色，具备优异的抗菌、抗炎和促进伤口愈合的能力。本研究将AR的应用从抗癌领域拓展至细菌感染治疗，并为靶向递送AR至铜绿假单胞菌相关感染提供了一条有前景的途径。鉴于T4P也存在于其他多种革兰氏阴性菌中，该策略具有应用于更广泛细菌感染精确治疗的潜力。最后，研究阐明协同MPTT/AR的治疗作用能够逆转伤口的严重炎症环境，通过诱导M2型巨噬细胞复极化、上调CD31和α-SMA表达促进血管生成，最终实现伤口愈合，为克服缺氧微环境下的抗菌治疗挑战提供了创新性的解决方案。