黏质沙雷氏菌LYGN1通过代谢物调控微生物群落促进黄瓜穴盘苗生长的机制研究

《Scientia Horticulturae》：Metabolite-mediated microbial community modulation by Serratia marcescens enhances cucumber seedling growth in artificial cultivation systems

本研究针对人工栽培系统中黄瓜幼苗质量提升的难题，探讨了植物根际促生菌（PGPR）Serratia marcescens LYGN1及其代谢物的促生机制。研究人员通过设置无菌水（CK）、无菌培养基（CM）、菌悬液（TB）和无细胞滤液（TF）四种处理，发现TB和TF处理均能显著提高幼苗活力指数（TF较CK最高提升100.15%）、根系活力（TB提升130.03%）及养分吸收，并重塑根际微生物群落，富集Sphingopyxis、Brevundimonas等有益菌属，提升氮磷代谢相关酶活性。代谢组学分析揭示LYGN1分泌吲哚-3-乙酸（IAA）、生物碱、有机酸等多种活性物质。该研究为LYGN1代谢物作为高效生物刺激剂在可持续育苗中的应用提供了理论依据。

　　

随着全球人口的持续增长，如何在减少农业化学投入的同时维持环境完整性，成为可持续粮食生产系统面临的严峻挑战。黄瓜（Cucumis sativus L.）作为葫芦科重要的蔬菜作物，在全球温室生产中占据关键地位。穴盘育苗技术是现代栽培中提升黄瓜产量和增强环境胁迫抗性的重要手段，也是生产高质量幼苗的主要方式。提升幼苗质量的重要措施之一便是添加植物根际促生菌（Plant Growth-Promoting Rhobacteria， PGPR），以促进幼苗生长并增强其潜在抗逆性。然而，在基于基质的人工栽培系统中，PGPR介导的促生机制，尤其是在穴盘育苗生产中的应用，其科学探索仍较为有限。

先前研究表明，黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LYGN1能够促进黄瓜和辣椒幼苗的生长，但其具体作用机制尚未完全阐明。特别是LYGN1分泌的胞外代谢物是否作为驱动幼苗生长促进的关键决定因素，仍有待揭示。不同的PGPR属被广泛用作天然生物刺激剂，以提高养分吸收效率和作物在非生物胁迫下的品质性状。许多来自有益细菌的化合物会影响根系构型并促进植物生长。例如，假单胞菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）的商业化PGPR制剂已通过根际定殖和养分动员证明了田间促生效果。研究表明，外源施加的PGPR能够在土壤中存活并繁殖，影响土著微生物，从而改变根际微生物的组成。黏质沙雷氏菌属是一类遗传多样的PGPR细菌，不同菌株具有不同功能，这些菌株有望成为有前景的生防制剂。 primarily，沙雷氏菌物种表现出显著的植物生长促进特性。例如，沙雷氏菌sp. H6释放的挥发性有机化合物（VOCs）显示出对拟南芥生长的促进作用。此外，沙雷氏菌属对多种环境胁迫表现出广谱抗性。内生菌黏质沙雷氏菌JG1能在多种重金属胁迫下显著促进宿主植物的生长。然而，沙雷氏菌在穴盘育苗系统中的应用在现有科学文献中鲜有报道。

基于前期研究发现黏质沙雷氏菌LYGN1在穴盘育苗中能显著促进黄瓜生长，研究人员提出假设：LYGN1的胞外代谢物同样具备植物生长促进效应，并可能影响基质中的根区环境。为此，研究团队通过盆栽实验，探究了黏质沙雷氏菌及其无细胞滤液对黄瓜生长的影响，重点关注根系活力、人工基质中营养相关酶活性以及黄瓜根际细菌群落的变化。此外，还利用非靶向代谢组学技术对LYGN1培养滤液的代谢谱进行了表征。这些发现阐明了LYGN1无细胞滤液的促生效应，并为其作为生物刺激剂的潜在功能提供了初步见解，为提升幼苗质量和推进PGPR在穴盘育苗中应用的技术框架奠定了科学基础。

为开展本研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：研究以从黄瓜根际分离的黏质沙雷cescens LYGN1（CGMCC 27,660）为材料，通过离心和0.22 μm膜过滤制备无细胞代谢物。黄瓜（‘中农72号’）种子消毒后播种于由草炭、蛭石和珍珠岩按体积比2:1:1混合的人工基质中，在人工气候室中培养。实验设四个处理：无菌水（CK）、无菌液体培养基（CM）、LYGN1菌悬液（TB）和LYGN1无细胞滤液（TF），于播种后第6天（子叶完全展开时）每株浇灌20 mL相应处理液。分别在接种后18天和32天取样，测定植株生长生理指标、基质理化性质及根际微生物群落。采用根扫描仪和FG-RIAS软件分析根系构型，TTC法测定根系活力，UV spectrophotometry测定基质酶活性，ICP-AES/AES测定植株和基质元素含量。通过16S rRNA基因V4区高通量测序分析根际微生物群落，并使用UPLC-ESI-MS/MS系统进行非靶向代谢组学分析。数据采用one-way ANOVA和Tukey's HSD检验进行统计分析。

3.1. LYGN1促进黄瓜生长并改变基质特性

基于基质总养分含量的主成分分析（PCA）显示不同处理间存在显著差异。LYGN1（TB）处理显著提高了基质和幼苗中的营养元素含量，TB处理导致基质中总氮（TN）、总磷（TP）和总钾（TK）浓度最高。基于植物生长参数的PCA进一步揭示处理显著影响植物生长。TB和TF处理的株高、茎粗、叶面积和SPAD值均显著高于CK组，证实LYGN1能促进黄瓜茎叶增厚和干物质积累。幼苗活力指数分析表明，TB和TF处理在两次取样时间点均显著高于CK。植株总生物量测定显示，施用LYGN1菌液及其代谢物显著增强了植物生物量积累，且在32 DAI时效果最为显著。

3.2. LYGN1应用诱导黄瓜根系改变

根系形态分析显示LYGN1处理引起显著变化。根系扫描图像表明，TB和TF组的黄瓜幼苗根系比CK更发达、更密集。接种LYGN1及其代谢物后，TB和TF处理的总根长、总根表面积、平均根直径、根体积和根尖数在18和32 DAI均显著高于CK。根系直径分布模式在不同处理间差异显著：CK组毛细根（直径0–0.3 mm）比例最高，而TB组最低。TB和TF组在0.3–0.6 mm和0.6–0.9 mm直径级别的根比例显著高于CK。TB组在较大直径级别（0.9–1.2 mm和>1.2 mm）占主导地位，粗根（>0.9 mm）比例最高。根系活力测定显示相似趋势，在32 DAI时，TB和TF组根系活力分别比CK提高了161.15%和82.21%。

3.3. LYGN1应用影响基质酶活性和营养元素

为评估不同处理对基质中营养相关酶活性的影响，研究人员定量评估了四个关键酶活性在两个生长阶段的变化。结果表明，TB处理诱导了多种酶活性的显著增强。TB和TF处理组的蔗糖酶活性在两个取样阶段均显著高于CK组。脲酶、中性磷酸酶和过氧化氢酶的酶活性变化趋势与蔗糖酶一致。特别地，在32 DAI时，TB和TF处理组的脲酶活性分别比CK高135.21%和92.03%。对照处理在所有测量的酶活性指标中均显示最低水平。TB处理和LYGN1代谢物（TF）处理在蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性上无显著差异，表明LYGN1的代谢副产物中可能存在多种与基质养分循环相关的胞外酶。基于ICP-OES的基质多元素浓度测定显示，TB处理显著增强了多种元素的总含量，总氮（TN）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）和铁（Fe）含量均有显著增加。

3.4. 基质指标与植物指标的相关性分析

相关性分析显示，基质钾含量（S-K）与铁（S-Fe）、磷（S-P）、钼（S-Mo）、钙（S-Ca）和镁（S-Mg）含量呈显著正相关。幼苗活力指数与株高呈负相关，与叶绿素含量呈正相关。茎粗与基质氮含量（S-N）呈正相关。添加LYGN1后，TB和TF组的基质元素含量和植物生长指标均较CK组显著增加，与相关性分析结果一致。根系活力与根直径、根体积和中性磷酸酶活性（S-NP）呈正相关。细菌群落多样性与叶绿素含量呈显著正相关，香农指数和Chao1指数与幼苗干重呈正相关。

3.5. LYGN1重塑黄瓜根际细菌群落结构

标准化后，样品测序深度为45,281，平均ASV数量为20,577。Alpha多样性指数分析显示，TB处理组在18和32 DAI的微生物多样性均显著高于对照，且随着黄瓜幼苗生长，多样性呈渐进式增加。Chao1指数分析显示，在18 DAI时，TF处理组的值显著低于其他所有处理；而在32 DAI时，TF组与对照或TB组无显著差异，但仍显著高于CM组。PCoA分析表明，四种处理显著分离，Adonis分析R2 = 0.541，PC1和PC2分别解释了总方差的39.92%和15.35%，表明实验处理显著改变了细菌群落的结构和组成。

在门水平上，优势细菌门为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和Patescibacteria，占细菌群落总量的85%以上。与CK组相比，TB和TF处理显著降低了厚壁菌门、放线菌门和绿弯菌门的相对丰度，而显著提高了拟杆菌门的相对丰度。在黄瓜幼苗生长后期，TB和TF处理显著改变了根际微生物群落组成：变形菌门和厚壁菌门相对丰度降低，而芽单胞菌门显著增加。优势属包括无色杆菌属、假单胞菌属和Rhodanobacter属，占细菌总数的25%以上。Specifically，接种LYGN1后，根瘤菌相关属和鞘氨醇盒菌属的相对丰度显著增加。而TB和TF处理中，青枯菌属、伯克霍尔德菌属相关复合群和热单胞菌属显著减少。TB处理导致根际沙雷氏菌属的相对丰度显著高于其他处理，表明LYGN1可能在根际定殖并发挥促生作用。通过微生物属与黄瓜幼苗生物量的Pearson相关性分析，鉴定出8个与植物密切相关的属，其中5个属与生物量呈显著正相关，3个属呈负相关。正相关属在TB组中的丰度高于其他组。

3.6. 微生物功能预测

研究采用两种不同方法预测微生物群落功能。FAPROTAX可预测微生物功能驱动的不同生物地球化学循环的显著差异。在32 DAI时，微生物群落受到显著影响，TB处理富集了固氮作用、细胞内寄生、暗硫化作用、烃类降解等功能。而LYGN1代谢物的应用则增强了纤维素分解、甲基营养型和外部寄生等潜在功能。BugBase功能预测分析显示，在32 DAI时，TB和TF处理中耐胁迫、兼性厌氧、生物膜形成、厌氧特性等性状显著富集。需氧菌、革兰氏阴性菌和潜在致病菌的功能则下降。

3.7. 黏质沙雷氏菌LYGN1分泌的胞外代谢物代谢组学分析

黏质沙雷氏菌LYGN1的胞外代谢组谱揭示了多种生物活性化合物，可分为不同的功能类别。基于UPLC-MS/MS代谢组学，共鉴定出1190种胞外代谢物，其中生物碱、氨基酸及其衍生物、萜类化合物是最丰富的类别。此外，还检测到脂质、酚酸和类黄酮，但其丰度较低。具体而言，相对丰度前20的代谢物分析显示，两种有机酸（十八碳-11E,13E,15Z-三烯酸和硬脂酸）的丰度显著高于其他化合物。此外，hupcrispatine、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和zizyberanal acid在整体代谢物谱中也表现出较高的丰度。代谢组学分析还在LYGN1中检测到植物生长素吲哚-3-乙酸。

本研究证实了黏质沙雷氏菌LYGN1及其胞外代谢物在人工基质中对黄瓜幼苗生长的显著促进作用。LYGN1胞外代谢物能直接刺激植物生长，提高叶绿素含量、改善根系构型、增加生物量和幼苗活力指数；同时，通过提升基质酶活性（如蔗糖酶、脲酶、磷酸酶），加速养分矿化，间接优化根际微环境。更重要的是，LYGN1接种重塑了基质微生物区系，提高了微生物多样性，富集了如鞘氨醇盒菌属、短波单胞菌属、沙雷氏菌属和根瘤菌相关有益菌属，抑制了青枯菌属等潜在病原菌，并增强了微生物群落的胁迫耐受性和养分循环功能（如固氮、纤维素分解）。代谢组学分析揭示了LYGN1分泌的IAA、生物碱、有机酸等多种活性物质是其发挥促生作用的重要物质基础。这些协同效应验证了LYGN1来源的代谢物可作为穴盘育苗生产中高效生物刺激剂的潜力。该研究不仅为利用PGPR代谢物提升幼苗质量提供了新策略，也为可持续农业中的微生物调控技术提供了理论支持。未来研究将侧重于解析LYGN1特定代谢物的促生分子机制及其驱动的微生物群落功能重塑，从而在表型增强之外解码其分子互作网络。