基于条形码式半定量侧向层析免疫分析技术用于血浆SARS-CoV-2抗体水平分级的研究

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Development of a semi-quantitative lateral flow immunoassay to classify the levels of SARS-CoV-2 antibodies in plasma

本研究针对传统侧向层析免疫分析(LFIA)在即时检测(POC)中仅能提供定性结果的局限性，开发了一种无需仪器的比色法半定量条形码式LFIA。研究人员通过优化高球形度金纳米颗粒(AuNPs)形态提升检测灵敏度，构建了可对抗SARS-CoV-2抗体水平进行低、中、高分级的多线检测体系。该技术与验证方法具有高度一致性（90%结果在参考值±1等级内），为低资源环境下实现无仪器定量检测提供了创新策略。

　　

在新冠疫情背景下，准确评估个体抗体水平对于监测免疫反应、指导疫苗接种策略以及筛选适合恢复期血浆治疗的血浆捐赠至关重要。然而，当前抗体检测的“金标准”方法——如空斑减少中和试验(PRNTs)、化学发光免疫分析(CLIAs)和酶联免疫吸附测定(ELISA)——虽然准确度高，但通常耗时较长，且需要昂贵的专业设备和训练有素的操作人员，这限制了其在资源有限地区或即时检测(Point-of-Care, POC)场景下的广泛应用。侧向层析免疫分析(Lateral Flow Immunoassay, LFIA)以其快速、便携和易用的特点，成为理想的替代技术，但传统LFIA大多只能提供“是”或“否”的定性结果，无法提供抗体浓度的具体范围信息，这大大限制了其在需要量化信息的场景（如免疫力水平评估）中的效用。尽管已有研究尝试通过引入荧光或拉曼信号等策略来提升LFIA的定量能力，但这些方法往往依赖于特定的仪器和复杂的数据处理，同样难以在资源匮乏地区普及。因此，开发一种无需复杂仪器、能够提供半定量结果的LFIA技术，成为连接定性与定量检测之间鸿沟的关键挑战。

为了应对这一挑战，由Laura M. Rey Gomez、Rena Hirani、David W. Inglis、Andrew Care和Yuling Wang组成的研究团队在《Sensing and Bio-Sensing Research》上发表了一项创新性研究。他们成功开发了一种基于条形码（或称阶梯式）设计的比色法、半定量且无需仪器的LFIA。该技术旨在对血浆中的SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）抗体水平进行分级（低、中、高）。研究的一个核心亮点是深入探究了金纳米颗粒(Gold Nanoparticles, AuNPs)的形态（球形度）对检测性能的影响，通过比较高度球形(S)、商业(C)和准球形(Q)的AuNPs，旨在找到既能提升灵敏度又易于合成和应用的纳米材料。最终构建的条形码LFIA在临床样本验证中表现出色，为在低资源环境下实现更信息化的血清学检测提供了有前景的策略。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，合成了三种不同形态的约50纳米金纳米颗粒（AuNPs），包括通过种子生长法合成的高度球形(S) AuNPs、通过改良Turkevich法合成的准球形(Q) AuNPs以及商业来源的(C) AuNPs，并利用透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见光谱(UV-Vis)、动态光散射(DLS)和纳米颗粒追踪分析(NTA)对其形貌、尺寸分布和稳定性进行了系统表征。其次，优化了AuNPs与SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike Protein)的生物偶联过程，通过金聚集测试(Gold Aggregation Test, GAT)确定了最佳蛋白包被浓度。接着，构建了用于检测抗SARS-CoV-2 IgG抗体的LFIA试纸条，其关键组成部分包括样品垫、结合垫（喷涂了功能化AuNPs）、包被有检测线（T线，固定羊抗人IgG抗体）和控制线（Ct线，固定抗SARS-CoV-2抗体）的硝酸纤维素膜以及吸收垫。此外，研究还利用图像分析软件（ImageJ, MATLAB）对检测结果进行半定量分析，通过计算检测线峰下面积(Area Under the Peak, AUP)并采用四参数逻辑(4PL)非线性模型进行曲线拟合，以确定检测限(Limit of Detection, LOD)。研究的样本来源包括由澳大利亚红十字会生命血液(Lifeblood)提供的COVID-19疫情前（2019年初，作为阴性对照）和疫情后（恢复期捐赠者，作为阳性样本）的血浆样本，所有样本使用均经过相关伦理委员会批准。

3.1. LFIA设计

本研究设计的LFIA旨在检测人血浆中的抗SARS-CoV-2 IgG抗体。其核心原理是：将不同形态的AuNPs与SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白进行生物偶联。当含有目标抗体的血浆样本加到试纸条上后，抗体与AuNPs-刺突蛋白复合物结合，形成的复合物在层析过程中被硝酸纤维素膜上固定的羊抗人IgG抗体（针对抗体的Fc片段）捕获，从而在检测线（T线）位置产生红色信号。控制线（Ct线）则包被有商业抗SARS-CoV-2抗体，用于捕获未与样本抗体结合的游离AuNPs-刺突蛋白复合物，作为实验有效性的内参。通过观察T线的出现与否及强度，即可判断样本中是否存在目标抗体。

3.2. 不同形态AuNPs的合成与表征

研究人员成功合成了三种AuNPs：通过种子生长法获得的高度球形(S)-AuNPs、通过改良Turkevich法获得的准球形(Q)-AuNPs以及商业来源的(C)-AuNPs。表征结果显示，S-AuNPs具有最高的球形度和单分散性（平均最大费雷特直径约49.1纳米，标准偏差10.6%），其局部表面等离子体共振(LSPR)峰更窄。C-AuNPs尺寸略大（约54.6纳米），表面略显棱角。Q-AuNPs的球形度最差，尺寸分布较宽。所有AuNPs的胶体稳定性均良好（Zeta电位 < -30 mV）。这些表征数据为后续比较其检测性能奠定了基础。

3.3. AuNPs生物偶联物和LFIA的优化

为确保AuNPs与刺突蛋白的有效结合，研究首先优化了偶联条件。在pH 8的硼酸盐缓冲液环境下，通过金聚集测试(GAT)确定了能有效防止盐诱导聚集的最佳刺突蛋白浓度：S-AuNPs和C-AuNPs为1微克/毫升，Q-AuNPs为1.5微克/毫升。结合效率计算表明，S-AuNPs的结合效率最高（99.6% ± 37%）。优化后的偶联条件被用于制备所有后续LFIA中使用的生物探针。

3.4. AuNPs形态对LFIAs的影响

为了评估不同形态AuNPs对检测灵敏度的影响，研究使用掺有已知浓度抗SARS-CoV-2 IgG抗体的血浆样本进行测试。结果显示，基于S-AuNPs的LFIA表现出最低的检测限(LOD)，为56.0纳克/毫升，比C-AuNPs (99.1纳克/毫升)和Q-AuNPs (107纳克/毫升)的检测限低约2倍。此外，S-AuNPs的剂量反应曲线斜率更陡，表明其具有更高的灵敏度。这表明，即使在高复杂度的血浆基质中，更高球形度和单分散性的AuNPs也能带来显著的灵敏度提升。

3.5. 阳性COVID-19人体样本的LFIA检测

使用真实临床血浆样本（10份阴性，10份阳性）进一步验证LFIA性能。结果显示，S-AuNPs基LFIA的灵敏度最高（90%），但特异性相对较低（50%），出现了部分假阳性结果。C-AuNPs基LFIA的特异性最高（60%），灵敏度为80%。Q-AuNPs基LFIA的灵敏度为90%，但特异性最低（40%）。假阳性的出现可能与血浆基质中内源性抗体的非特异性结合有关。尽管存在假阳性，但所有AuNPs类型均能清晰区分阴性和阳性样本的平均信号强度，其中S-AuNPs显示的差异最大。这表明在复杂临床样本中，不同形态AuNPs的性能差异不如在加标样本中明显，但仍显示出S-AuNPs的潜在优势。

3.6. 半定量LFIA模式设计

研究设计了三种不同的条形码式T线排布模式，以探索最佳的半定量显示效果：模式1（三条T线包被相同浓度捕获抗体）、模式2（T线捕获抗体浓度递增）、模式3（T线捕获抗体浓度递减）。使用高抗体滴度血浆的系列稀释液进行测试后发现，模式2和模式3能实现T线的依次出现或消失，提供了更好的等级间对比度。虽然模式1的定量性能（LOD更低）稍好，但模式2因其在等级区分上的清晰度而被选用于后续临床样本测试。

3.7. 临床COVID-19样本的半定量LFIA检测

最终，研究采用模式2的条形码LFIA（使用性能最佳的S-AuNPs）对10份已知抗体水平的COVID-19阳性血浆样本进行了测试。通过设定T线信号强度超过控制线信号15%为阳性阈值，将抗体水平划分为低（1条T线阳性）、中（2条T线阳性）、高（3条T线阳性）三个等级。与作为参考标准的ELISA检测结果进行比较后显示，条形码LFIA的分类结果与参考方法有50%完全一致，但高达90%的样本其LFIA分类结果落在参考等级的±1个等级之内。这表明该条形码LFIA在无需仪器的情况下，能够对抗体水平进行有效的半定量分级，尽管在精确匹配参考方法上仍需进一步优化。

综上所述，本研究成功开发了一种创新的条形码式半定量LFIA，用于检测和分级血浆中的SARS-CoV-2抗体水平。研究证实，通过种子生长法合成的具有高球形度的柠檬酸盐包被AuNPs能够显著提高LFIA的检测灵敏度。尽管在临床样本测试中特异性有待进一步提升，但构建的条形码LFIA在区分抗体水平等级方面表现出良好的潜力，90%的检测结果与参考值相差不超过一个等级。这项工作的重要意义在于，它为实现低资源或POC环境下无需仪器的半定量血清学检测提供了一种实用且具有前景的技术路径，有望弥补传统定性LFIA与实验室定量方法之间的鸿沟，为传染病的免疫监测、血浆捐赠筛选等应用场景提供更便捷、信息更丰富的工具。作为一项原理验证性研究，未来需要在更大样本量、长期稳定性以及针对其他靶标的适用性方面进行更深入的评估和优化。