基于光固化水凝胶的结核分枝杆菌病理质控芯片：一种提升结核病诊断准确性的新策略

《Bio-Design and Manufacturing》：Pathological quality control chips for tuberculosis

本文报道了一种新型结核分枝杆菌(MTB)病理质控(QC)芯片的研究。为解决结核病病理检测中存在的误诊、漏诊率高(5%-30%)的问题，研究人员开发了将MTB和HeLa细胞精确整合到光固化明胶甲基丙烯酰(GelMA)水凝胶中的QC芯片。该芯片表现出优异的批内批间一致性(CV<5%)，可在-80°C稳定储存一年，并在240例临床样本(200例特殊染色，40例PCR)验证中效果100%。该研究为病理检测QC提供了新框架，有望提升结核病临床诊断工作流的可靠性。

　　

结核病至今仍是全球重大的公共卫生挑战。据世界卫生组织(WHO)估计，2023年全球新发结核病例约1080万，每年死亡人数超过120万。在中国，平均每家传染病专科医院每年约进行5000例结核分枝杆菌(MTB)病理检测。病理组织检测，如抗酸杆菌(AFB)染色，是结核病诊断的常用方法，尤其对于肺外结核(占15%-20%)和体液样本阴性的肺结核病例。尽管定量聚合酶链式反应(qPCR)检测MTB有效，但其灵敏度仅50%-84%，无法完全满足临床需求。临床上，MTB病理检测的质量控制(QC)依赖于阳性存档的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。然而，FFPE组织的重复性差，仅适用于MTB特殊染色的定性验证，而不适用于高灵敏度qPCR检测的定量验证。这是由于MTB在组织中分布不均、细菌载量低、组织处理保存复杂、DNA提取纯化挑战及样本污染等因素，导致约5%-30%的MTB假阴性、假阳性和临界病例。因此，不同实验室间MTB检测存在显著差异，进一步影响临床决策。此外，使用人源组织可能引发伦理问题。故与其他临床样本相比，MTB病理组织检测需要标准化样本进行全过程QC，以提高检出率并减少实验室间变异。

为解决上述问题，浙江大学等单位的研究人员在《Bio-Design and Manufacturing》上发表了题为"Pathological quality control chips for tuberculosis"的研究论文，开发了一种新型QC芯片用于MTB检测。该研究构建了一种定量病理QC模型，通过将MTB和HeLa细胞精确、均匀地整合到光固化水凝胶中，然后切片制成QC芯片。研究人员发现，该QC芯片在批内和批间变异方面无显著差异(变异系数<5%)，并在-80°C下可稳定保存一年。此外，这些芯片在240例临床样本(200例特殊染色和40例PCR)测试中效果100%。该方法除提高结核病检出率外，还具有可视化、定量化和可持续生产等优点。总体而言，该工作为开发病理检测QC芯片提供了新框架，为提升临床诊断工作流可靠性提供了可靠解决方案。

为开展本研究，作者主要采用了以下几项关键技术方法：使用低膨胀明胶甲基丙烯酰水凝胶(GelMA, GM-1M)作为核心骨架，以全基因组可追溯的MTB QC菌株作为定量QC产品；通过超声混合和瞬时交联技术构建成分均匀分散的MTB QC模型；采用投影基3D打印(PBP)系统制作柔性模具，并优化铸造工艺；利用临床来源的FFPE组织样本(来自浙江台州医院)进行性能验证；通过组织处理、切片、H&E染色、AFB染色、免疫荧光(IF)染色、DNA提取和qPCR等多种技术系统评估QC芯片的性能。

3.1 基质系统的制备与表征

研究采用MTB QC菌株(H37Rv)，经75%(体积分数)乙醇完全灭活2小时，并通过14天亚培养验证无菌落形成单位。通过流式细胞术准确测定细菌载量，确保可控掺入基质。HeLa细胞作为内参PCR对照和细胞模拟物，与灭活MTB共封装于生物相容性GelMA水凝胶中。选择5%(0.05 g/mL)GM-1M作为基础浓度以平衡成型性和脆性。流变学分析表明，高细胞密度(5x10⁷ cells/mL)对水凝胶粘度影响最小。通过优化超声分散方案(37°C，40 kHz，钢珠共振)实现均匀细菌分布，同时保持基质完整性。光固化动力学研究显示凝胶时间一致，特征性S形固化曲线证实细胞组分对加工影响最小。快速光交联能力有效防止组分沉降，确保MTB分布均匀。机械表征研究显示，细胞掺入后材料显著硬化(杨氏模量：8.47±0.01 kPa vs. 17.93±1.33 kPa)，达到与人肝实质(15-20 kPa)相当的刚度，而断裂伸长率无显著差异。细胞掺入基质表现出增强的回弹性，这对QC芯片制造过程中确保操作和处理时的结构完整性至关重要。

3.2 模型与QC芯片的制备

采用基于PBP技术的双模塑法制备内尺寸2 mmx2 mmx2 mmx8 mm的惰性无毒PDMS柔性模具。将基质系统铸造成尺寸均匀的模型，在405 nm光下完全固化60秒后脱模，获得边缘规则、质量一致的QC模型。固定24小时后，QC模型的外观和重量无显著变化。脱水后长轴和短轴均收缩约50%，未观察到明显溶解、开裂或结构损伤。基于此，模型适于石蜡包埋。处理后QC模型的外观合格率为90.24%。在切片阶段可连续获得结构完整、厚度均匀的3μm和5μm QC芯片，为定量QC的高质量组织学分析提供便利。

3.3 QC芯片的形态学性能验证

3.3.1 H&E染色可视化分析

比较无细胞、中浓度(5x10⁵ cells/mL)和高浓度(5x10⁷ cells/mL)基质系统的切片质量。结果显示，高浓度组切片平整度最佳，皱褶率和裂纹密度显著低于其他两组。故后续所有TB0-TB4梯度QC芯片均采用5x10⁷ cells/mL基质系统制备。制备的五组QC芯片经H&E染色后表面光滑、结构完整、细胞分布均匀、无空隙或裂纹，平均评分均大于95分，满足微阵列分析的高标准。石蜡块切片评分在室温储存12个月后保持不变。进一步研究冷冻保存条件发现，-80°C组仅偶尔观察到<300μm²的微腔，而-20°C组1个月后出现300-450μm²的腔隙，12个月后腔隙进一步扩大，导致显著结构损伤。石蜡包埋样本和-80°C储存样本的结构稳定性可满足后续应用要求。

3.3.2 MTB定量与稳定性评估

为验证QC芯片中MTB的均匀性，采用AFB/IF染色双系统。TB0组未检测到MTB；其余阳性QC芯片在高倍镜下显示均匀的细菌分布，无明显的聚集、背景染色或细菌碎片。随后考察长期储存对形态和计数的影响。形态学方面：QC微阵列石蜡包埋12个月和-80°C冷冻12个月后，结构保持完整，AFB/IF阳性定位准确，细胞结构清晰。而-20°C冷冻12个月后，组织明显收缩，出现腔隙，结构完整性下降。细菌载量方面：与对照组相比，前四组(石蜡/12个月、-80°C/1个月、-80°C/12个月、-20°C/1个月)的MTB计数无显著差异，但-20°C/12个月组有显著差异。线性与批间一致性方面：TB1-TB4芯片的MTB密度与初始细菌浓度呈线性相关。四批TB3芯片的 pairwise 比较显示MTB计数无显著差异，证实了过程的准确量化和可重复性。

3.4 QC芯片的分子性能验证

3.4.1 批内一致性

通过纯化核酸并进行微量UV检测评估批内一致性。五组QC芯片的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值分别为：TB0(2.00±0.03)、TB1(1.95±0.01)、TB2(1.98±0.02)、TB3(1.93±0.01)和TB4(1.93±0.02)，CV<5%。QC芯片中的核酸浓度与HeLa细胞浓度呈正相关。五组QC芯片均满足FFPE组织的PCR验收标准。qPCR结果显示，阴性对照芯片和阴性标准品均无S形扩增。内参曲线以及阳性标准品结果正常。TB1-TB4 QC芯片的扩增曲线正常，C值CV均低于5%。TB0至TB4的Ct值呈现良好的线性关系，TB1-TB4精确匹配10倍稀释模式(相邻梯度Ct值差约3.14)。表明构建的QC芯片具有良好的批内一致性和宽检测范围，可根据需要选择合适的芯片验证实验的灵敏度和特异性。

3.4.2 批间一致性

为验证批间一致性，选择四个独立批次的TB3，每批九个QC芯片进行分子检测。QC芯片的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.8-2.1之间。平均DNA浓度为(27.24±1.15) ng/μL (CV=4.23%)。四批QC芯片的平均Ct值分别为30.01±0.41、29.40±0.29、30.12±0.46和30.90±0.43。统计分析显示，仅TB3A和TB3C间差异不显著，其余各批间 pairwise 比较均显示显著性。但36个样本的总平均Ct值为30.1±0.66 (CV=2.2%)，且批间Ct值最大偏差<1，表明观察到的差异可能归因于随机误差，并在可接受范围内。证明不同批次的QC芯片具有高度一致性，增强了数据可比性和实验方法的标准化。

3.4.3 DNA稳定性

为评估DNA储存稳定性，将新鲜脱模的QC模型在液氮中快速冷冻一分钟，随后于-80°C储存。储存后分析显示，1个月和12个月后DNA纯度和浓度均未出现显著降解，所有样本均保持在可检测范围内。储存1个月后，对照组和-80°C储存组的扩增曲线和Ct值无显著差异。但至12个月时，出现轻微但显著的差异，尽管最大Ct差异仍低于1。评估室温储存6个月和12个月的石蜡包埋样本稳定性，未观察到DNA纯度和浓度的显著下降，Ct值与基线水平相当。

3.5 临床应用

3.5.1 AFB染色

使用TB0(阴性)和TB4(阳性)QC芯片作为外部QC参考，将测试组织贴于同一载玻片进行同步染色操作。对浙江省台州医院的200例临床FFPE组织切片进行了AFB染色的QC。TB0芯片在所有情况下均保持阴性，特异性100%，而TB4芯片在每个病例中均显示典型的红色染色杆菌，灵敏度100%。芯片尺寸仅1 mmx1 mm，易于与测试组织区分，消除了模糊性。

3.5.2 qPCR检测

本研究使用TB0和TB2 QC芯片及试剂盒标准品评估qPCR检测FFPE组织的准确性和重复性。在进行的12次测试中，TB0始终保持阴性，表明无污染，特异性达100%。然而，TB2 QC芯片在不同操作者进行的前六次测试中结果不一致：两次阴性、三次阳性、一次临界结果。阳性标准品(质粒DNA)结果稳定。优化操作流程(标准化切片厚度、改进脱蜡、实施多步抽吸清洗、加强操作者培训)后，后续六次运行TB2芯片结果100%阳性。迄今为止，已为40例临床样本提供了全面的TB QC，阳性率为30%(12/40)。

本研究首次报道了一种适用于MTB检测全过程的定量、可长期储存的QC芯片，适用于组织病理学染色和分子检测。该系统克服了试剂盒QC材料的缺点，促进了MTB病理检测方法的可重复性。QC芯片的MTB(靶标)定量必须准确且可重复，核酸质量需满足PCR检测的准入标准。芯片中的细胞模拟真实组织，确保QC模型的处理时间与真实组织一致，以及核酸提取效率的准确性。不同于现有需重现复杂病理环境的器官/组织芯片，QC芯片无需复现MTB感染引起的肉芽肿微环境，因此不需要特定细胞类型。故选择增殖快、批间变异小的HeLa细胞。采用稳定性好、符合ISO 17034要求的MTB QC菌株作为靶标，以提高灵敏度并实现特异性评估。

在芯片制造过程中，传统琼脂铸造法存在机械强度低、易开裂变形、难以分散MTB聚集体等挑战。为此，系统优化了材料和方法。在分散过程中，为避免超声混合对细胞的损伤，选择具有温和空化作用的40 kHz超声水浴，并使用3 mm钢珠作为共振源以放大容器内的超声效应，防止传导衰减。槽温精确控制在(37±2)°C，从而获得高均匀性、优异流动性的基质。此外，QC模型采用高度分散的组分铸造。

QC模型的储存稳定性直接决定其性能。若采用生物样本的冷冻保存策略，反复冻融循环中形成的冰晶可能损伤QC模型的结构及内部细胞/细菌的形态。这种损伤程度取决于冻融循环次数、温度变化速率和QC模型的组成。研究表明，使用DMSO进行玻璃化和超低温快速冷冻保存生物材料有助于抑制冰晶形成。因此，本研究采用"10%(体积分数)DMSO + 液氮快速冷冻 + -80°C低温储存"的三重策略：DMSO稳定细胞膜，玻璃化防止冰晶形成，快速冷冻和深低温进一步减轻损伤。在此条件下储存的QC芯片在超过12个月后染色性能和DNA质量未出现显著变化。另一种常见储存方法是石蜡包埋。蜡的物理屏障效应有效防止水迁移和氧化，从而维持孔结构完整性和抗原/核酸稳定性。一旦QC模型铸成蜡块，可在室温下长期储存(超过12个月)而无需低温设施。单次铸造的QC模型可长期使用，使不同实验室能在较长时间内使用质量一致的QC产品，从而促进实验室间数据比较和结果共享。

临床实践中，AFB因其成本低、结果快而成为结核病的主要筛查方法。但其检出率低(灵敏度仅12.0%-30.8%)常需使用二次染色方法。常需外部对照以确保染色可靠性。新型QC芯片提供准确的定量结果，可用于与测试组织同步染色和诊断。它克服了传统阳性存档蜡块细菌载量不均、重复性差和存在伦理问题的缺点。本研究对200例特殊染色病例进行了全过程QC，结果显示染色准确可靠，无需进一步验证。

在通过临床PCR认证的实验室内，qPCR被认为是检测FFPE组织中MTB的最佳方法，灵敏度约50%-84%，是AFB染色的数倍。但其操作步骤繁琐，影响因素多。临床和实验室标准协会(CLSI)建议使用与测试样本基质组分相同的QC材料实施核酸检测全面QC，从而最小化假阳性或假阴性风险。

此外，本研究使用流式细胞术准确量化四个阳性梯度QC芯片中的MTB含量，产生了可靠的校准曲线，既满足日常QC需求，也可作为国家病理质控中心统一的实验室间质量评估标准，应用前景广阔。随着生物3D打印的最新进展，若能实现精确光场控制、精确墨水响应和机械平衡维持，QC制造可进一步自动化和标准化。

总之，本研究开发的QC芯片系统涵盖了MTB检测的全过程。该QC芯片表现出优异的一致性和稳定性，实现了MTB的均匀梯度分布，为MTB检测工作流提供了可靠参考。这种固态QC模型与组织内细菌检测的处理程序高度兼容，克服了各种检测试剂盒中液体标准材料存在的技术瓶颈，如核酸交联导致的组织破坏和降解。采用天然全基因组MTB菌株作为QC材料，实现了与主流特殊染色技术和核酸扩增检测试剂盒的兼容。此外，全面评估了该方法的灵敏度和稳定性，确保其作为比较实验室间结果的有价值工具。而且，由于MTB分布均匀可控，QC芯片提供宽检测范围，克服了现有检测方法的局限性。总体而言，除了优化整个MTB检测过程外，所提出的QC芯片显著提高了样本检测的准确性，实现了及时准确的临床诊断。此外，它还可作为培训相关技术人员的实用工具。

综上所述，本研究开发了一种新型QC芯片，旨在提升临床病理检测工作流的可靠性。该研究纳入临床分离菌株以标准化不同细菌群落和各种培养批次的MTB检测，并计划纳入耐药MTB菌株，以进一步完善QC体系。