外泌体新星——外泌小体在肝细胞癌中的分子标记鉴定与致癌机制探索

《Cell Reports》：Identification of molecular markers and exploration of the oncogenic role of exomeres in hepatocellular carcinoma

本刊推荐：为解决肝细胞癌(HCC)中细胞外囊泡与颗粒(EVPs)亚型exomeres(EMs)缺乏特异性分子标记和功能机制不清的问题，研究人员通过超速离心分离、蛋白质组学分析和功能实验，鉴定出GALNS和MAN2B1作为潜在EM标志物，并揭示HCC来源的EMs通过激活PI3K/AKT/mTOR通路、促进细胞周期进程和诱导脂质代谢紊乱等多种机制驱动肿瘤发生发展，为HCC诊断和治疗提供了新靶点。

　　

在肿瘤研究的浩瀚星空中，细胞外囊泡犹如神秘的信使，在细胞间传递着决定命运的信息。近十年来，肿瘤来源的小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)因其在肿瘤发生和转移前微环境形成中的关键作用而备受关注。然而，sEVs本身是一个异质性群体，随着不对称流场流分离技术(asymmetric flow field-flow fractionation, AF4)等高精度分离方法的发展，科学家们得以窥见这一群体中更为精细的亚型。2018年，张衡团队利用AF4技术发现了一种新型纳米颗粒——外泌小体(exomeres, EMs)，它们比传统的sEVs更小(直径小于50纳米)，且不具有典型的膜结构，但其功能特性却一直笼罩在迷雾之中。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)作为全球常见的恶性肿瘤，其高复发率和转移率一直是临床治疗的难点。尽管sEVs在HCC中的作用已有较多研究，但EMs这一新亚型在HCC中的特异性分子标记和功能机制仍知之甚少。由于缺乏公认的EM标志物，相关研究进展缓慢，严重阻碍了我们对HCC中细胞间通讯网络的全面理解。正是基于这一背景，香港大学病理学系Judy Wai Ping Yam教授团队在《Cell Reports》上发表了这项开创性研究，旨在揭示EMs在HCC中的分子特征和致癌机制。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究。他们通过顺序超速离心技术从多种人源和鼠源正常肝细胞及HCC细胞系中分离sEVs和EMs，利用透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)进行形态学表征，采用蛋白质组学(label-free mass spectrometry)进行成分分析，并通过体外功能实验(克隆形成、迁移侵袭)和多种小鼠模型(原位肝移植、教育模型、肺定植模型)验证EMs的致癌功能。同时，研究还涉及RNA测序(RNA sequencing)、代谢组学(metabolomic profiling)和脂质组学(lipidomic profiling)分析，以及通过免疫印迹(western blot)进行蛋白表达验证。

分离与表征正常和癌肝细胞系来源的细胞外囊泡和颗粒

研究团队首先采用Zhang等发表的顺序高速超速离心方案从9个人源细胞系(包括2个正常肝细胞和7个HCC细胞系)和4个鼠源细胞系中分离EVPs。TEM结果显示sEVs呈现典型的"杯状"形态，而EMs则主要表现为无膜结构的"点状"颗粒。粒径测量证实EMs(人源：6.776-32.166 nm；鼠源：9.271-20.795 nm)显著小于sEVs(人源：44.785-185.662 nm；鼠源：40.416-140.986 nm)。有趣的是，尽管EMs的蛋白浓度更高，但质谱鉴定的蛋白数量却少于sEVs。免疫印迹分析显示sEVs表达阳性标志物(Alix、TSG101、CD9)，而EMs不表达这些标志物，但两者均缺乏阴性标志物GM130，证实了它们作为不同纳米颗粒亚群的特性。

肝脏sEVs和EMs具有独特的蛋白质组组成

蛋白质组学分析揭示了sEVs和EMs之间的显著差异，两者仅有中等程度的重叠蛋白。主成分分析显示它们属于相对独立的亚群。sEVs中富集了与内吞作用、高尔基体囊泡运输等相关的蛋白，而EMs则主要与溶酶体通路和多种代谢过程(如糖胺聚糖代谢)相关。重要的是，sEV生物发生相关蛋白(如VPS和Rab GTPases)在sEVs中富集而在EMs中缺失，提示两者可能通过不同的生物合成途径产生。

鉴定GALNS和MAN2B1作为潜在的EM标志物

由于缺乏公认的EM特异性标志物，研究人员首先评估了文献中提出的候选标志物(PCSK9、Ago1/2、HSP90等)，发现它们在22个细胞系中的表达并不一致。通过比较分析所有细胞系中EMs特异性表达的蛋白，他们成功鉴定出两个在所有细胞系EMs中一致表达的蛋白：半乳糖胺(N-乙酰)-6-硫酸酯酶(galactosamine (N-acetyl)-6-sulfatase, GALNS)和甘露糖苷酶α类2B成员1(mannosidase alpha class 2B member 1, MAN2B1)。免疫印迹实验进一步验证了这两个蛋白在EMs中的特异性表达，表明它们有潜力作为EM的特异性分子标志物。

HCC来源的EM在肿瘤发生和转移中的功能作用

功能实验显示，与正常肝细胞(MIHA)来源的EMs相比，HCC细胞(特别是高转移性MHCC97L和MHCCLM3)来源的EMs能显著增强受体细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。动物实验进一步证实：用LM3-EMs预处理肿瘤细胞后进行原位肝移植，可显著促进肝脏肿瘤生长和肺转移；通过EMs"教育"小鼠模型(预先注射EMs营造转移前微环境)也观察到肿瘤生长和转移的加速；肺定植实验中，与LM3-EMs共注射的肝母细胞表现出更强的肺转移能力。这些结果共同证明了HCC来源EMs的致癌特性。

高转移性HCC来源的EMs激活PI3K/AKT/mTOR通路

机制研究发现，高转移性HCC细胞来源的EMs中80个蛋白共同上调，KEGG分析显示这些蛋白与多种癌症通路相关。转录组分析表明，用LM3-EMs处理正常肝细胞后，PI3K/AKT/mTOR通路相关基因显著富集。基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)和免疫印迹实验证实LM3-EMs能有效激活PI3K/AKT/mTOR通路，表现为AKT、mTOR和p70-S6的磷酸化水平升高。进一步研究发现，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)在转移性HCC-EMs中特异性高表达，敲低EGF可削弱EMs对PI3K/AKT/mTOR通路的激活能力，表明EGF在这一过程中发挥关键作用。

鼠源HCC EMs促进肿瘤发生和细胞分裂激活

在免疫健全小鼠模型中，鼠源HCC细胞(Hepa1-6、p53^-/-;Myc、p53^-/-;Ras)来源的EMs同样表现出促进受体细胞恶性表型的能力。蛋白质组学分析和流式细胞术显示，HCC-EMs处理能促进细胞从G0/G1期向S期和G2/M期进展，伴随细胞周期蛋白(cyclin D、cyclin A、cyclin B)和有丝分裂标志物(pH3)的表达上调。体内实验进一步验证了鼠源HCC-EMs在促进肿瘤生长和转移方面的作用。

EMs的组织定向能力

体内分布实验显示，静脉注射的EMs主要富集在肝脏，其次为肾脏、肺、脑和骨骼。细胞摄取实验发现，激活的THP-1细胞和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)对EMs的摄取能力最强，表明EMs的分布具有器官和细胞类型特异性。

鼠源HCC EMs诱导脂质代谢紊乱

代谢组学分析显示，Hepa1-6-EMs处理可导致细胞葡萄糖水平升高，但糖酵解、三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)和磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)相关代谢物减少。脂质组学分析发现HCC-EMs处理显著增加饱和脂肪酸(saturated fatty acids, SAFAs)比例，特别是极长链脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFAs)如C22:0、C23:0和C24:0。机制上，HCC-EMs上调脂肪酸延长酶(elongase of very long chain fatty acids, ELOVL1、ELOVL3、ELOVL7)的表达。体内"教育"模型实验证实HCC-EMs处理可导致肝脏脂质沉积增加、肝功能指标(ALT、AST)升高以及ELOVLs蛋白水平上调。

本研究系统鉴定了GALNS和MAN2B1作为EMs的特异性分子标志物，为这一新兴研究领域提供了重要的工具和标准。研究首次全面揭示了HCC来源EMs通过多种机制(激活PI3K/AKT/mTOR通路、促进细胞周期进程、诱导脂质代谢重编程)驱动肿瘤发生发展的功能，不仅深化了我们对HCC肿瘤微环境中细胞间通讯的理解，也为HCC的诊断生物标志物开发和靶向治疗策略设计提供了新的思路。值得注意的是，EMs与sEVs在生物发生途径、蛋白组成和功能特性上的显著差异，提示它们可能代表了一类独立的细胞间通讯媒介，这为未来研究开辟了新的方向。然而，作者也指出本研究的局限性，如仅使用了超速离心一种分离方法、主要关注了癌细胞系以及尚未完全阐明EMs的具体形成机制等，这些都为后续研究留下了有价值的探索空间。随着技术的不断进步，EMs这类纳米颗粒有望成为癌症诊疗的新靶点，为攻克HCC等恶性肿瘤提供新的希望。