综述：肠道微生物组宏基因组学在临床实践中的应用：弥合研究与精准医学之间的差距

《Gut Microbes》：Gut microbiome metagenomics in clinical practice: bridging the gap between research and precision medicine

本综述系统阐述了肠道微生物组宏基因组学如何作为精准医学的新支柱，通过（mNGS）、（FMT）等技术，在感染性、炎症性、代谢性及肿瘤性疾病中展现出卓越的诊断、（AMR）基因检测及个体化治疗潜力。文章强调，尽管面临方法学标准化、功能注释不足及伦理监管等挑战，但通过多组学整合、纵向队列及跨部门协作，必将加速其向临床的转化。

　　

ABSTRACT

肠道微生物组宏基因组学正逐渐成为精准医学的基石，为改进诊断、风险分层和治疗开发提供了非凡的机遇。高通量测序技术的进步揭示了与传染性、炎症性、代谢性和肿瘤性疾病相关的稳健微生物特征。当前的临床应用包括病原体检测、抗菌药物耐药性分析、基于微生物群的疗法以及肠型指导的患者分层。然而，向常规护理的转化受到显著障碍的阻碍，包括方法学变异、有限的功能注释、生物信息学标准化的缺乏以及全球人群代表性不足。本综述综合了当前的转化策略，强调了对假设驱动设计、多组学整合、纵向和多中心队列以及机制验证的需求。我们还审视了塑造临床格局的关键伦理、监管和公平性考量。实现微生物组信息护理的全部潜力将需要全球统一的标准、跨部门合作以及确保科学严谨和公平获益的包容性框架。

Introduction

人类肠道微生物组由胃肠道中驻留的数万亿微生物组成，通过代谢、免疫和神经通路在维持健康和影响疾病方面发挥着至关重要的作用。越来越多的证据现在将微生物组定位为不仅是共生的被动参与者，更是宿主生理的主动调节者，加强了其在基础生物学和临床实践中的相关性。过去十年中，高通量测序技术的进步彻底改变了我们对这个复杂生态系统的理解，宏基因组学已成为解码微生物动态、宿主-微生物相互作用及其在疾病发病机制中作用的基本工具。这一技术飞跃使得不仅能够以前所未有的分辨率表征微生物群落，还能探索其临床相关性。

对肠道微生物组的临床兴趣迅速增长，这得益于认识到微生物组成和功能不仅是疾病的生物标志物，也是可修改的治疗靶点。宏基因组分析现在有助于疾病诊断、抗菌药物耐药性（AMR）基因检测，以及基于微生物特征的个性化治疗策略。例如，宏基因组分析已在培养阴性感染中识别出致病病原体，并指导了感染性心内膜炎、下呼吸道感染和疑似脑脊液感染等病症的优化治疗。此外，肠型分析（根据微生物组组成对个体进行分层）为精准诊断和定制治疗选择增加了宝贵的维度。

然而，尽管取得了这些进展，微生物组科学的临床转化仍然有限。关键挑战，包括缺乏标准化方案、不一致的可重复性、复杂的数据解读和监管障碍，继续阻碍其融入常规医疗保健。此外，个体间变异性、大量未表征的微生物基因组以及缺乏普遍接受的“健康”微生物组定义，使这一转变进一步复杂化。这些局限性表明，对临床应用的热情必须与对基本假设和基础设施准备情况的严格评估相匹配。最近弥合这些差距的努力包括建立标准化框架、经过验证的参考材料、整合性多组学方法以及伦理考量。这些倡议反映了一个日益增长的共识，即进展需要的不仅仅是科学创新，还必须涉及系统层面的思考和治理。此外，微生物学家、临床医生、生物信息学家和政策制定者之间的跨学科合作越来越被认为是释放肠道微生物组宏基因组学全部临床潜力的关键。

本综述批判性地审视了肠道微生物组宏基因组学在临床实践中的当前格局，重点介绍了有前景的应用，识别了持续存在的障碍，并提出了将微生物组见解转化为精准医学的策略。通过同时应对机遇和挑战，我们勾勒出一条路线图，以加速肠道微生物组科学融入主流医疗保健。

Clinical application of gut microbiome metagenomics

测序技术和数据分析的快速进步将肠道微生物组研究推向了精准医学的前沿。不再将微生物组视为被动标志物；相反，全面的多组学研究强调了其在疾病表征和管理中积极且不可或缺的作用。例如，Ning等人对来自13个队列的超过1300个宏基因组和400个代谢组进行了大规模多组学整合，涵盖了炎症性肠病（IBD）患者和健康对照。他们识别出在IBD中一致的微生物物种变化以及显著的代谢物变化，直接将微生物群落紊乱与疾病状态联系起来。重要的是，他们构建的微生物组-代谢组相关性网络阐明了与炎症相关的受干扰微生物通路和功能。基于这些多组学特征构建的诊断模型在区分IBD与对照方面达到了高精度，展示了整合的微生物组-代谢组分析在疾病诊断和亚型分层方面的引人注目的临床效用。

同样，Qin等人应用高分辨率血清代谢组学分析了2型糖尿病（T2D）患者的肠道微生物组成和功能。他们识别出111种与T2D显著相关的肠道微生物衍生代谢物，特别是那些与支链氨基酸代谢、芳香族氨基酸和脂质通路相关的代谢物，显示出对疾病进展的强大预测能力。由这些微生物衍生代谢物生成的诊断面板曲线下面积（AUROC）超过0.80，强化了基于微生物组的早期干预和个性化疾病管理策略的潜力。

此外，基于微生物组的诊断能力超越了代谢疾病。Zhou和Sun通过开发一种新颖的机器学习框架证明了这一点，该框架整合了宏基因组数据和临床参数，以更高的准确性预测结直肠癌（CRC）风险。他们统一的特征工程、中介分析、统计建模和网络分析的综合流程不仅优于现有的预测方法，还突出了关键的CRC相关类群，如升高的脆弱拟杆菌，揭示了潜在的疾病机制。

Precision diagnostics and disease management

宏基因组测序通过实现不依赖培养的、灵敏且特异的病原体检测，彻底改变了传染病诊断，特别是在传统方法失败的复杂或培养阴性感染中。Daquigan等人通过将鸟枪法宏基因组测序与高分辨率16S rRNA基因分析相结合，直接从粪便样本中准确检测艰难梭菌，证明了这一点。他们的创新方法对密切相关的物种实现了超过99%的真阳性诊断率和极低的假阳性，强调了其临床可靠性和支持治疗决策的潜力，尽管宏基因组学在临床微生物学实验室中以足够的检测灵敏度和特异性识别低丰度致病病原体的真正适用性需要严格的前瞻性测试。

Wilson等人进一步展示了宏基因组学的变革潜力，他们将不偏倚的宏基因组下一代测序（mNGS）应用于疑似中枢神经系统（CNS）感染患者的脑脊液（CSF）。该方法检测了广泛的病原体谱，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫，而无需预先假设，在常规检测为阴性的病例中将诊断率提高了6.4%。重要的是，mNGS发现了标准微生物学遗漏的意外和罕见病原体，通过靶向抗菌或抗寄生虫治疗直接影响临床管理。这些研究例证了mNGS如何克服常规诊断的局限性并增强传染病管理的精确性。

类似地，Wallander等人将16S rRNA测序应用于诊断已接受抗菌治疗患者的骨和关节感染，在这种情况下，基于培养的诊断常常失败。他们的方法比单独培养提高了约18%的诊断率，检测到了常规方法遗漏的多种微生物和苛养微生物。这种增强的病原体检测使得更精确的抗菌药物管理成为现实，减少了不必要的广谱抗生素使用并指导了靶向治疗，证明了分子诊断在复杂传染病场景中的直接临床益处。在血流感染中，Grumaz等人直接将鸟枪法宏基因组学应用于危重脓毒症患者的血液样本，实现了高诊断灵敏度，并比传统培养早最多30小时识别出病原体。同时检测耐药基因，他们的方法能够实现及时、靶向的抗菌治疗，减少对经验性治疗的依赖并改善了脓毒症管理。

Targeted therapeutics and treatment optimization

宏基因组学通过能够直接从临床样本中快速检测AMR基因和识别病原体，彻底改变了精准抗菌治疗。这种方法减少了不必要的广谱抗生素的使用，在培养阴性或多微生物感染中尤其重要，从而改善了患者结局并支持了抗菌药物管理。例如，Charalampous等人开发了一种快速的6小时纳米孔宏基因组测序工作流程，并去除了宿主DNA，用于诊断下呼吸道细菌感染。该方法与培养相比达到了96.6%的灵敏度和41.7%的特异性，并通过qPCR确认了100%的准确性。它还实现了AMR基因的实时识别，展示了病原体检测和耐药性分析的双重能力。这有助于早期、量身定制的治疗调整，并减少对经验性广谱抗生素的依赖，推进了患者特异性治疗和抗菌药物管理。Liu等人使用实时牛津纳米孔测序对阳性血培养进一步推进了这种方法。他们的方法在一小时内实现了物种水平的病原体鉴定，并在15小时内获得了基因组草图，优于常规诊断。早期AMR基因检测允许及时的治疗修改，增强了临床决策，并可能提高存活率。

除了抗菌药物选择，宏基因组学关键性地指导了个性化微生物组疗法，如粪菌移植（FMT）。Wu等人将宏基因组学和代谢组学结合用于儿科复发性CDI（rCDI）、伴有胃肠道症状的孤独症谱系障碍（ASD）和肠易激综合征（IBS）患者。他们证明，成功的FMT取决于稳定的供体菌株定植和关键代谢物（如短链脂肪酸、胆汁酸衍生物、色氨酸代谢物）的恢复，这些代谢物支持肠道和免疫稳态。该研究还揭示了供体-受体年龄相容性影响这些结局，强调了在儿童中最大化治疗效力可能需要年龄匹配的供体。相反的情况可能适用于老年人，其中年轻的微生物群可以对衰老的微生物群发挥有益功能。例如，Boehme等人在小鼠中证明，从年轻动物到年长动物的FMT可以部分逆转与年龄相关的神经免疫和行为变化，表明年轻的微生物群可能发挥 rejuvenating 效应。鉴于这些发现是临床前的，需要在人类中进行转化研究，并严格控制供体年龄、饮食、粘膜相关与腔内群落、表型复制性状和功能结局，以从混杂关联中梳理出真正的因果效应。总之，这些研究表明供体年龄应根据临床目标进行定制，儿科疾病中的相容性和代谢稳定性与老年或年龄相关病症中的潜在功能增强。临床结局的优化也可能受益于FMT后的纵向宏基因组监测，以促进早期检测定植失败或不利的微生物变化，允许及时的临床干预，通过提供更清晰、更具因果信息性和机制丰富性的定植轨迹见解来改善患者管理。

Enterotyping and predictive medicine

肠型通过根据影响代谢、药物反应和疾病风险的显性肠道微生物组组成模式对个体进行分层，丰富了个性化医学。最初由Arumugam等人提出，他识别了三种稳健的肠型（分别以拟杆菌、普雷沃菌和瘤胃球菌为主），独立于年龄、国籍或BMI，这一概念已获得转化相关性。Wu等人通过在一个超过1000名中国人的队列中识别出一种与肥胖相关的、以Megamonas为主的肠型，扩展了肠型分析。功能基因组学揭示，Megamonas rupellensis降解肌醇（一种脂质吸收的天然抑制剂），从而促进脂质摄取和体重增加。通过体外肠道类器官测定和小鼠模型的验证确认了这种机制联系，突出了肠型分层在评估肥胖风险和指导精准干预方面的潜力。

在肿瘤学中，Zhu等人证明，在不同的癌症类型中，独特的肠道微生物群落及其代谢物调节宿主对免疫检查点抑制剂的反应。对165名患者粪便样本的多组学分析，并在另外700多名患者中得到验证，识别出五种与治疗反应相关的肠型。他们整合微生物和代谢物特征的预测模型稳健地区分了应答者与非应答者。值得注意的是，在非应答者中富集的代谢物苯乙酰谷氨酰胺在体内损害了抗PD-1疗效，强调了肠型特异性微生物特征作为指导精准免疫治疗的生物标志物的功能重要性。类似地，Zhu等人报告，黑色素瘤患者基线肠道微生物组肠型预测了免疫检查点抑制剂引起的免疫相关不良事件。富含Faecalibacterium的肠型与增强的无进展生存期相关，但不良事件风险较高，而以拟杆菌为主的肠型赋予了对不良事件的抵抗力，但与较差的结局相关。这种双重预测能力突出了肠型分析作为平衡免疫检查点抑制剂疗效和安全性的关键工具。

Expanding the clinical landscape

肠道微生物组宏基因组学正迅速扩大其临床相关性，超越了胃肠道和传染性疾病，现在成为心血管、神经学和自身免疫性疾病等系统性疾病的关键参与者。在一项发表于《细胞》的大规模研究中，Li等人识别出肠道细菌Oscillibacter作为胆固醇代谢的潜在调节剂。通过对来自弗雷明汉心脏研究的1429名参与者进行宏基因组和代谢组学分析，他们发现Oscillibacter与血浆和粪便胆固醇呈负相关，与有利的脂质谱相关。多组学整合和体外验证通过保守的酶途径确认了其胆固醇代谢能力，产生致动脉粥样硬化性较低的代谢物。这些发现将特定的微生物类群定位为心血管干预的预测性生物标志物和治疗靶点。

类似地，Guan等人证明他汀类药物治疗调节急性冠状动脉综合征患者的肠道微生物群。使用16S rRNA测序和血清代谢组学，他们观察到接受他汀类治疗的患者有益菌类（如长双歧杆菌、Anaerostipes hadrus）富集，而促炎物种如粪便副拟杆菌减少。功能预测表明，这些组成变化支持脂质代谢和抗炎活性，瑞舒伐他汀比阿托伐他汀促进了更有利的微生物和代谢谱。瑞舒伐他汀（商品名Crestor）和阿托伐他汀（商品名Lipitor和Atorvaliq）是属于HMG-CoA还原酶抑制剂类别的降脂药物，通常称为他汀类药物。这两种药物通过抑制参与内源性胆固醇合成的关键肝酶起作用，从而降低低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平，同时增加高密度脂蛋白胆固醇。这些药物被广泛用于管理血脂异常、支持心血管风险降低，并且通常与饮食和运动等生活方式改变结合使用。这些结果表明，药物-微生物组相互作用也可能影响治疗效力，应在心血管疾病管理中加以考虑，尽管在解释从16S扩增子数据推断的功能性时应谨慎，如本研究报告的那样。

在神经疾病中，肠道微生物群的改变越来越被认为是疾病进展的促成因素。Metcalfe-Roach等人使用鸟枪法宏基因组学分析了176名帕金森病患者和100名对照者的粪便样本，临床进展随访至5年。该研究揭示了帕金森病患者微生物多样性降低、碳水化合物代谢通路丢失以及蛋白水解和核糖体功能富集。值得注意的是，普拉梭菌的减少解释了大部分观察到的功能紊乱。微生物特征预测了加速的运动症状进展，强化了肠道微生物组作为神经退行性疾病的疾病生物标志物和治疗靶点的价值。

在孤独症谱系障碍中，Aziz-Zadeh等人整合了43名孤独症和41名神经典型儿童的粪便代谢组学、任务功能性磁共振成像和行为评估。他们识别出孤独症个体中神经保护性色氨酸代谢物，特别是犬尿酸和吲哚乳酸的减少。这些缺陷与在社会情绪处理过程中脑岛中部和扣带回中部的神经激活改变相关，这介导了微生物代谢物与症状严重程度之间的关系。这个研究实例强调了肠道微生物代谢与脑功能之间的机制联系，强化了神经发育障碍中的肠-脑轴。

自身免疫性疾病也展示了微生物组介导的发病机制潜力。Jiang等人采用两样本孟德尔随机化设计，使用微生物数量性状位点和免疫性血小板减少性紫癜风险的全基因组关联研究数据。分析显示，埃希氏菌/志贺氏菌类群增加了免疫性血小板减少性紫癜风险，而粪球菌表现出保护作用。这些发现表明微生物失调可能因果性地导致自身免疫性血小板破坏，识别了免疫调节治疗的新靶点。尽管有这些有前景的进展，临床实施仍然受到方案变异性、方法学标准化缺乏和复杂数据解读的挑战。然而，跨疾病领域的广泛关联牢固地将肠道微生物组宏基因组学定位为精准健康策略的基石。

Translating microbiome science into clinical practice

Clinical relevance and study design

微生物组科学成功的临床转化需要严谨设计的、假设驱动的研究，并具有直接为患者护理提供信息的疾病特异性终点。纵向队列特别有价值，因为它们捕捉时间动态，控制个体间变异性，帮助区分原因和结果，跟踪疾病进展或治疗反应，并识别在时间波动中持续存在的稳定、临床相关的生物标志物。例如，Th?nert等人对236名早产儿进行了一项全面的纵向研究，揭示抗生素和非抗生素药物显著影响肠道微生物组组成，并且持续的低多样性肠道微生物组与后来发生坏死性小肠结肠炎相关。类似地，Vandeputte等人表明，在健康成人中，肠道微生物丰度的日间个体内变异通常超过个体间差异，意味着横断面采样很容易错过这些波动或错误地表示微生物稳定性。这些研究强调了纵向设计对于捕捉动态微生物变化的关键价值，这是单时间点研究无法可靠检测的。

为了从如此复杂的时间分辨微生物组数据中提取有意义的见解，研究人员可以利用为重复测量和组成数据设计的统计和计算工具。诸如广义线性混合效应模型、贝叶斯分层模型以及零膨胀或负二项混合效应模型等方法允许进行稳健的分析，尽管存在缺失数据和非独立性。并行地，像MaAsLin2这样的工具能够在考虑纵向结构、混杂因素和组成约束的同时，实现微生物类群与临床或表型变量之间的特征关联分析。总之，这些方法使得发现具有潜在临床相关性的预测性、时间敏感性微生物标志物成为可能。然而，虽然纵向研究提供了随时间变化的微生物组动态见解，但横断面研究通过识别与疾病状态相关的人群水平微生物特征来补充这一点。总之，这些方法能够实现稳健的生物标志物发现，并为临床应用提供信息转化管道。

值得注意的是，尽管纵向采样可能是诊断某些临床障碍的首选方法，但及时诊断可能取决于横断面数据，因为重复采样可能成本效益不高，或者在某些患者中确实无效。当在人群规模上进行时，肠道微生物组的横断面研究在识别疾病生物标志物和阐明病理生理机制方面已被证明是无价的。例如，Wu等人例证了使用横断面数据将微生物组特征转化为可操作诊断的早期努力。他们使用16S rRNA测序和机器学习，识别出预测CDI易感性的微生物谱。通过比较CDI患者、非CDI腹泻患者和健康对照的粪便样本，他们在CDI病例中发现了独特的类群特征，为感染风险提供了经过验证的、临床可操作的生物标志物。Franzosa等人使用纵向、多组学研究设计扩展了这种临床相关性，以研究IBD。通过跨发现和验证队列的鸟枪法宏基因组学和非靶向液相色谱-质谱联用代谢组学，他们识别了疾病特异性的微生物和代谢物变化，包括鞘脂和胆汁酸改变，揭示了超过100个稳健的微生物-代谢物关联。这种整合分析提供了对IBD病理生理学的机制见解，并支持了动态的、个性化的疾病监测策略的开发。

Vujkovic-Cvijin等人强化了多中心队列设计的价值。他们对不同人群进行了宏基因组学分析，并纵向监测代谢疾病结局。该研究强调了宿主混杂因素如何影响微生物特征，强调了大型、异质性数据集对于稳健和可推广的生物标志物发现的必要性。为了系统评估转化进展，Lee等人提出了一个结构化框架，用于对跨转化阶段（从T0（发现）到T2+（公共卫生影响）的基因组学研究进行分类。他们基于MEDLINE的分析显示，只有一小部分人类基因进展超越早期发现，转化努力集中在肿瘤学和高外显率疾病上。将这种结构化方法应用于微生物组科学有助于识别高潜力研究，指导资助和监管优先事项，并加速从实验室到临床的转变。总之，结构良好的研究设计和转化框架对于实现微生物组研究的临床潜力是不可或缺的。

这些研究强调了横断面设计在捕捉与疾病相关的微生物特征方面的关键价值，这些特征可以作为早期检测和治疗靶向的潜在生物标志物。虽然横断面研究提供了重要的关联，但将这些发现与纵向数据整合可以增强我们对因果关系、疾病进展和机制验证的理解。大规模、多中心试验对于确保可重复性、临床相关性和监管接受也至关重要。例如，Piccinno等人在结直肠癌研究中展示了一个模型工作流程，从大规模数据整合开始以识别微生物生物标志物，随后进行假设驱动的验证，并开发非侵入性诊断工具来预测具有临床意义的结局。

Validation strategies and stakeholder collaboration

鉴于微生物组组成在个体和人群间固有的变异性，稳健的验证策略对于确保基于微生物组的诊断和治疗的可靠性和临床效用至关重要。Lee等人在一项大规模、跨队列的接受免疫检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者研究中说明了这一需求。尽管识别出在应答者中富集的类群，如Akkermansia muciniphila和Roseburia spp.，但在一个队列上训练的机器学习模型当应用于其他队列时表现不佳，证明了交叉验证和方法学协调的重要性。

动物研究也提供了关键的机制见解和验证。Gopalakrishnan等人将肠道微生物组组成与黑色素瘤抗PD-1治疗反应联系起来，并将FMT植入无菌小鼠体内证实了因果作用。Singer等人显示新生儿肠道微生物组操作可预防小鼠迟发性败血症，而人类研究支持预测性微生物生物标志物。Langelier等人结合宏基因组学和宿主转录组学开发了呼吸道感染诊断方法。然而，小鼠的转化性FMT研究有几个固有的局限性。近交系无特定病原体和无菌模型不能完全再现人类生理或共同进化的微生物组，限制了转化相关性，因为人类来源的细菌通常不能准确模拟在一般人群中通常观察到的肠道微生物群落。饮食差异进一步加剧了这种差异，并且正在进行的使用西方饮食的营养研究旨在增强这种人性化微生物群模型的生理相关性。虽然宏基因组方法可以通过捕捉菌株水平和功能变异来提高分辨率，但此类方法不能完全克服跨物种差异，突出了需要谨慎解读并在互补的人类研究中验证。

同样重要的是早期和持续地与临床医生和其他利益相关者合作，以确保研究设计解决现实世界的临床需求。Robinson等人通过让临床医生参与一项关于艰难梭菌诊断的研究，展示了这种方法的有效性。他们的跨学科团队，包括临床医生、代谢组学专家和计算科学家，使用气相色谱-质谱联用和预测模型对186名住院患者的粪便样本进行分析，以识别区分真正CDI与定植的代谢特征。升高的Stickland发酵产物（当某些肠道细菌氧化和还原配对氨基酸以产生能量时产生的代谢物）和耗竭的共轭次级胆汁酸成为关键标志物，实现了更准确和及时的诊断。这种跨学科、利益相关者整合的模型例证了严格的验证、现实世界相关性和合作对于加速微生物组科学向精准诊断和疗法转化至关重要。

Technological foundations of microbiome research

Amplicon-based 16S rRNA gene sequencing

当代肠道微生物组研究从根本上受到测序技术进步的塑造，这些技术克服了基于培养的方法的限制，后者不足以捕捉微生物多样性和非细菌成分。其中，16S rRNA基因扩增子测序由于其成本效益和在大人群中调查细菌类群的能力，仍然是一种广泛使用的方法。这种方法在生物标志物发现和个性化诊断开发中发挥了重要作用。

Zhang等人对跨越不同环境的35,889个微生物物种和157,390个样本的16S rRNA基因扩增子测序进行了全面评估。采用in silico Qscore框架，该研究系统地评估了各种测序参数，包括引物选择、平台、流程和参考数据库，确认了该方法在属水平分析上的可靠性，以及在优化条件下物种水平的分辨率。这些发现强化了16S测序在大规模研究中的持续效用及其在生物标志物发现和个性化医学中的转化相关性。然而，16S rRNA测序存在固有的局限性。其有限的分类分辨率和易受PCR扩增偏倚影响可能导致关键微生物群体的代表性不足，特别是新的或特征不清的谱系。Eloe-Fadrosh等人通过比较超过6000个鸟枪法宏基因组组装与16S数据集突出了这一局限性。他们发现广泛使用的引物未能扩增大约10%的小亚基rRNA序列，不成比例地排除了候选门成员和某些古菌，从而强调了扩增子策略的分类盲点。

进一步的局限性在于该方法无法解析密切相关的菌株。Johnson等人比较了常规短读长扩增子测序与使用PacBio环状共识测序的全长（约1500 bp）16S测序。他们的研究结果表明，靶向可变区的短读长（例如V4）主要局限于属水平分类，而全长环状共识测序读长，通过纠错和基因组内拷贝定相增强，能够通过检测细尺度核苷酸变异进行物种甚至菌株水平的区分。与此互补，Olm等人引入了in Strain，一种能够通过组装基因组的单核苷酸多态性分析识别种群微多样性的宏基因组工具。该方法允许高分辨率菌株追踪，这是16S扩增子测序所缺乏的能力。

长读长测序技术的最新创新解决了其中几个局限性。通过PacBio SMRT技术进行的全长16S rRNA基因测序能够对完整的约1500 bp基因进行测序，与仅靶向有限可变区（例如V3–V4，约300 bp）的短读长方案形成对比。Buetas等人证明，全长读长显著提高了物种水平分类的准确性（74%对短读长的55%），从而允许改进的系统发育分辨率。Lin等人将全长16S测序应用于代谢相关脂肪性肝病中的肠道微生物组分析，表明当纳入机器学习模型时，该方法实现了优于短读长方法的诊断准确性（曲线下面积=0.87对0.70）。这些发现强调了该方法在疾病诊断和风险分层中的转化潜力。

计算分析的进步进一步提升了16S数据集的分析效用。Wu等人开发了Taxa4Meta，一种基于机器学习的元分析框架，旨在通过校正批次效应、人口统计学协变量和区域引物偏倚来协调跨研究扩增子数据。应用于多个队列，Taxa4Meta识别了CDI、IBS和IBD的可重复微生物特征，实现了高曲线下面积值和稳健的跨队列验证。该平台例证了计算协调如何能够增强现有16S数据用于现代精准微生物组研究。

总之，虽然16S rRNA基因扩增子测序仍然受到分辨率和偏倚的限制，但长读长技术和先进分析流程的最新创新显著扩展了其价值。因此，该方法继续作为微生物组科学的基础工具，现在具备了更大的分类精度和跨研究可比性，适用于研究和临床背景。

Shotgun metagenomics and functional profiling

虽然基于扩增子的测序提供了有价值的分类学见解，但全基因组鸟枪法宏基因组学（WGS）能够更全面、无偏地表征微生物群落。它不仅以高分辨率捕捉分类多样性，还捕捉功能基因内容，包括代谢通路、毒力因子和AMR基因。Bars-Cortina等人对156份粪便样本进行了16S rRNA和鸟枪法宏基因组学的比较分析，样本涵盖健康个体、晚期结直肠病变患者和结直肠癌病例。鸟枪法宏基因组学相对于16S产生了更高的α多样性、减少的数据稀疏性和更广泛的分类覆盖范围，而两种方法都识别出重叠的癌症相关特征（例如小单胞菌）。重要的是，鸟枪法数据支持 marginally 更优的机器学习分类器，突显了WGS在疾病预测中的潜在优势。关键的是，鸟枪法宏基因组学也便于直接的功能分析。Wilson等人将WGS应用于95名个体（59名健康，36名患有哮喘）的粪便样本，识别出长链脂肪酸生物合成通路的富集和抗生素抗性基因丰富度的增加。值得注意的是，大环内酯类抗性基因ermF与脆弱拟杆菌毒素共现，说明了在疾病背景中毒力和抗性因子的共定位。

快速功能分析的临床效用由Purushothaman等人证明，他们优化了基于纳米孔的长读长WGS方案，用于从临床拭子中提取DNA。他们的方法能够在数小时内实时识别ESKAPE病原体和抗生素抗性基因，与基于培养的诊断方法一致。类似地，Ota等人采用宏基因组和宏转录组测序来分析医院废水，识别出活跃的抗性基因表达（例如mexS、acrR、mexR）和存活的多重耐药Serratia nevei，突出了功能宏转录组学在监测抗生素耐药性方面的价值。

Spatial and genome architecture mapping with Hi-C

除了线性测序，空间基因组学技术如