USP7稳定IGF2BP2通过K33连接去泛素化驱动胰腺癌基质活化及吉西他滨耐药的新机制

《Cell Reports》：IGF2BP2 stabilized by USP7 promotes cancer-associated fibroblast activation and attenuates gemcitabine sensitivity in PDAC

本研究聚焦胰腺导管腺癌(PDAC)中m6A阅读器IGF2BP2在自噬流高激活状态下仍能维持蛋白稳定的分子机制。研究人员发现去泛素化酶USP7通过移除IGF2BP2的K33连接多聚泛素链，阻止其经自噬-溶酶体途径降解。累积的IGF2BP2通过识别PDGFA mRNA的m6A修饰增强其稳定性，激活癌相关成纤维细胞(CAFs)，进而诱导化疗抵抗。靶向USP7/IGF2BP2/PDGFA通路可显著增强PDAC对吉西他滨的敏感性，为克服PDAC化疗耐药提供了新策略。

　　

胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度最高的肿瘤之一，以其极高的死亡率和强烈的治疗抵抗性而闻名。尽管近年来对PDAC的认识不断深入，但其治疗效果仍不理想，尤其是化疗耐药问题突出。肿瘤微环境(TME)在PDAC的进展和耐药中扮演关键角色，其中癌相关成纤维细胞(CAFs)的活化及其导致的致密基质屏障是PDAC化疗抵抗的重要机制。因此，深入解析PDAC微环境的形成机制，寻找新的治疗靶点，是当前PDAC研究的重要方向。

与此同时，RNA表观遗传修饰，特别是N6-甲基腺嘌呤(m⁶A)修饰，在PDAC发生发展中的作用日益受到关注。m⁶A阅读器IGF2BP2能够稳定多种致癌基因的mRNA，在多种肿瘤中发挥促癌作用。有趣的是，在自噬流高度激活的PDAC细胞(PCCs)中，IGF2BP2的蛋白水平却异常升高，这表明PDAC中可能存在某种机制抵抗IGF2BP2的降解。解析这一矛盾现象背后的分子机制，可能为靶向PDAC提供新的治疗思路。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，研究人员揭示了去泛素化酶USP7通过稳定m⁶A阅读器IGF2BP2，驱动PDAC基质活化并诱导吉西他滨耐药的新机制。研究发现USP7通过直接结合IGF2BP2并移除其K33连接的多聚泛素链，阻止IGF2BP2通过自噬-溶酶体途径降解。累积的IGF2BP2通过识别PDGFA mRNA 3'非翻译区(3' UTR)的m⁶A修饰，增强其稳定性，促进血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)的分泌，进而激活肌成纤维样癌相关成纤维细胞(myCAFs)，导致胶原沉积和化疗抵抗。重要的是，药理抑制USP7/IGF2BP2/PDGFA通路可显著增强PDAC对吉西他滨的敏感性。这些发现不仅揭示了m⁶A修饰与蛋白质稳态之间的交叉对话，也为克服PDAC化疗耐药提供了新的治疗策略。

本研究综合运用了多种关键技术方法：通过多组学数据分析（包括来自CPTAC、TCGA等数据库的5个独立PDAC队列的RNA测序数据和单细胞RNA测序数据）筛选与预后相关的m⁶A调控因子；利用免疫共沉淀(Co-IP)和体外去泛素化实验验证蛋白质相互作用；采用RNA免疫沉淀(RIP)和双荧光素酶报告基因实验分析RNA-蛋白质相互作用；通过患者来源异种移植(PDX)模型和细胞来源异种移植(CDX)模型进行体内药效评价；结合免疫荧光(IF)、RNA荧光原位杂交(FISH)和空间转录组学分析靶点表达的空间分布。研究涉及的PDAC组织样本来自浙江大学医学院附属第二医院的患者。

RESULTS

IGF2BP2在PDAC细胞中表现出增强的蛋白稳定性

通过对五个大型独立队列的单因素分析，研究人员发现 among 22个m⁶A调控蛋白中，IGF2BP2的表达水平与PDAC患者的预后显著相关。与RNA测序结果一致，IGF2BP2在PDAC组织中的蛋白水平也显著升高。单细胞RNA测序分析表明IGF2BP2主要在癌细胞而非基质或免疫细胞中表达。尽管PDAC细胞中存在自噬流的过度激活，且IGF2BP2可通过自噬-溶酶体途径降解，但IGF2BP2的蛋白水平和稳定性在PDAC细胞中仍显著高于人胰腺导管上皮细胞(HPDE6)。考虑到泛素化在调控蛋白质自噬降解中的关键作用，研究人员推测可能存在某种上调的去泛素化酶(DUB)移除了IGF2BP2的多聚泛素链，从而在高自噬状态下阻止了IGF2BP2的降解。

USP7通过自噬途径阻止IGF2BP2的蛋白降解

研究人员首先证实了IGF2BP2存在多聚泛素化修饰。通过定量蛋白质组学分析和全基因组CRISPR筛选数据的交叉分析，发现USP7是调控IGF2BP2稳定性的潜在DUB。实验结果表明，敲低USP7可显著降低IGF2BP2的蛋白水平，而过表达USP7则增加IGF2BP2蛋白水平。USP7敲低显著缩短了IGF2BP2的半衰期，而敲低自噬相关基因ATG5或ATG7，或使用自噬抑制剂氯喹(CQ)或3-甲基腺嘌呤(3-MA)可拮抗USP7敲低引起的IGF2BP2降低。进一步研究发现，选择性自噬货物受体SQSTM1是介导IGF2BP2自噬降解的关键分子。这些结果表明USP7通过阻止IGF2BP2经自噬-溶酶体途径的降解来促进其蛋白稳定性。

USP7直接结合IGF2BP2并移除其K33连接的泛素链

免疫共沉淀和免疫荧光结果显示USP7与IGF2BP2存在直接相互作用和共定位。分子对接预测表明USP7通过KH3和KH4结构域直接与IGF2BP2结合。去泛素化功能实验证实野生型USP7能够移除IGF2BP2的多聚泛素链，而酶活失活突变体USP7-C223S则无此功能。相反，敲低USP7或药理抑制USP7的酶活性会显著增加IGF2BP2蛋白的多聚泛素链。通过构建仅含单一赖氨酸的泛素突变体，研究人员发现K33连接的泛素化是IGF2BP2蛋白多聚泛素链的主要形式，且USP7能够有效移除IGF2BP2蛋白上的K33连接多聚泛素链。

累积的IGF2BP2介导胶原沉积和肌成纤维样CAF活化

基因本体(GO)富集分析和基因集富集分析(GSEA)显示，IGF2BP2高表达的PDAC中肿瘤微环境相关通路显著富集，特别是细胞外基质(ECM)组织和胶原形成。临床样本分析显示IGF2BP2阳性上皮细胞比例与胶原面积呈显著正相关。在细胞来源异种移植(CDX)模型中，敲低IGF2BP2可显著增强PDAC对吉西他滨的敏感性，并减少α-SMA阳性细胞比例和胶原面积。单细胞RNA测序分析表明IGF2BP2阳性PDAC细胞比例与myCAFs比例呈显著正相关。研究人员分离了原代人CAFs，并使用全反式维甲酸(ATRA)诱导CAFs静息。将静息CAFs(qCAFs)暴露于对照或IGF2BP2敲低PDAC细胞的条件培养基(CM)中，发现IGF2BP2敲低PDAC细胞的CM可抑制qCAFs的活化，表现为脂滴储存水平升高和myCAF标志物表达降低。

PDGFA是IGF2BP2的潜在下游靶标

通过整合单细胞RNA测序、IGF2BP2的RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)和PANC1细胞的RNA测序数据，研究人员发现ITGB1、SORT1、LAMA4和PDGFA是IGF2BP2的潜在底物。其中，PDGFA在IGF2BP2敲低后显著下调，且在细胞通讯分析中显示IGF2BP2阳性PDAC细胞向胰腺星状细胞(PSCs)的通讯概率显著改变。加入PDGFR抑制剂伊马替尼可逆转IGF2BP2敲低引起的qCAFs活化抑制，表明PDGFA在IGF2BP2调控的PSC活化中起主导作用。

IGF2BP2通过识别m⁶A修饰促进PDGFA的稳定性和翻译

敲低IGF2BP2降低了PDGFA的蛋白水平和PDGF-AA的分泌水平，而过表达IGF2BP2则产生相反效果。患者来源异种移植(PDX)模型显示IGF2BP2与PDGFA蛋白水平呈显著正相关。IGF2BP2过表达延长了PDGFA mRNA的半衰期，而敲低IGF2BP2则缩短其半衰期。RNA荧光原位杂交结合免疫荧光显示IGF2BP2与PDGFA mRNA在临床样本和PDAC细胞中存在显著共定位。RNA免疫沉淀实验证实IGF2BP2直接与PDGFA mRNA结合。基于m⁶A测序数据和SRAMP预测服务器，研究人员在PDGFA转录本的3' UTR预测了高置信度的m⁶A修饰位点。双荧光素酶报告基因实验表明，过表达IGF2BP2显著增加了携带野生型3' UTR的荧光素酶活性，而对突变型3' UTR无影响，证实IGF2BP2以m⁶A依赖性方式稳定PDGFA mRNA。

药理抑制USP7/IGF2BP2/PDGFA通路增强PDAC对吉西他滨的敏感性

USP7敲低或药理抑制可降低PDGFA的表达，并抑制CAFs的活化。在PDX模型中，USP7抑制剂P5091或PDGFR抑制剂安罗替尼与吉西他滨联用可显著增强抗肿瘤疗效。组织学分析显示P5091或安罗替尼治疗显著降低了PDX模型中的胶原沉积面积和α-SMA阳性区域。空间转录组数据分析进一步验证了IGF2BP2阳性PDAC细胞与ACTA2阳性CAFs的空间共定位。TCGA数据的Kaplan-Meier分析表明USP7和IGF2BP2高表达的患者总生存期显著缩短。

讨论与结论

本研究首次揭示了USP7作为IGF2BP2的去泛素化酶，通过移除K33连接的多聚泛素链来维持IGF2BP2蛋白稳定性，从而在自噬流高度激活的PDAC细胞中实现IGF2BP2的异常累积。更重要的是，研究阐明了IGF2BP2通过m⁶A依赖性方式稳定PDGFA mRNA，促进PDGF-AA分泌，进而激活胰腺星状细胞(PSCs)和肌成纤维样CAFs，驱动胶原沉积和化疗抵抗的完整分子通路。

这些发现不仅揭示了m⁶A修饰与蛋白质稳态系统之间的新型交叉对话机制，还从肿瘤细胞与基质细胞相互作用的角度阐释了PDAC肿瘤微环境形成的新机制。研究证实靶向USP7/IGF2BP2/PDGFA轴可有效抑制CAFs活化和胶原沉积，增强吉西他滨的疗效，为克服PDAC化疗耐药提供了有前景的治疗策略。此外，研究还提示靶向肿瘤细胞中异常激活的特定信号轴来调节肿瘤微环境，而非直接消除CAFs，可能是一种更精准且有效的治疗思路。

尽管本研究存在一些局限性，如临床前模型可能无法完全模拟PDAC肿瘤微环境的复杂性，单细胞RNA测序数据的稀疏性可能影响细胞定义的准确性等，但研究结果无疑深化了我们对PDAC发病机制的理解，为开发新的联合治疗策略奠定了重要的理论基础。未来研究应聚焦于扩大队列多样性，在更生理相关的体内模型中验证发现，并探索靶向USP7/IGF2BP2/PDGFA轴的临床疗效。