源自金银花的类外泌体纳米囊泡通过调节肠道微生物群来预防急性肝衰竭

《International Journal of Nanomedicine》：Honeysuckle-Derived Exosome-Like Nanovesicles Protect Against Acute Liver Failure by Modulating Gut Microbiota

金银花衍生纳米泡剂（HNVs）通过调节肠道菌群和抑制肝脏炎症反应，显著改善LPS/GalN诱导的急性肝衰竭小鼠的肝损伤和生化指标，证实其安全性和双重靶向机制。

　　急性肝衰竭（ALF）是一种罕见但具有极高致死率的临床综合征，其病因包括病毒感染、药物或毒素损伤以及自身免疫性疾病。目前，治疗ALF的主要手段依赖于肝移植，但该方法不仅成本高昂，而且存在较高的手术风险。由于大多数治疗策略仅针对单一机制，因此开发一种安全、有效且经济的多靶点药物成为迫切需求。

本研究中，我们从干金莲花中提取了类似外泌体的纳米囊泡（HNVs），并评估其在由脂多糖/葡聚糖（LPS/GalN）诱导的ALF小鼠模型中的治疗潜力。首先，我们通过冷冻电镜（Cryo-EM）、透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）对HNVs进行了表征，并确认其在体外模拟胃肠道环境中的稳定性。随后，我们验证了HNVs在小鼠体内的生物安全性和分布情况。接着，我们构建了ALF模型，并测试了HNVs对该模型的治疗效果。通过RNA测序、16S rRNA分析以及Western blot和实时定量PCR等互补技术，我们进一步阐明了HNVs在缓解ALF中的作用机制。

研究结果表明，HNVs显著改善了ALF小鼠的病理症状。具体而言，HNVs使血清中的ALT水平降低了1.89倍，AST水平降低了1.95倍。此外，HNVs还减轻了由LPS/GalN引起的肝细胞坏死和炎症细胞浸润。研究还表明，HNVs缓解ALF的机制主要包括：一方面，它们通过穿过受损的肠道屏障，直接作用于肝脏，抑制肝脏的免疫炎症反应，从而改善ALF；另一方面，它们通过调节肠道菌群，恢复肠道屏障完整性，减少肠道来源的LPS向肝脏转移，从而防止进一步的肝损伤。

综上所述，我们开发了一种新型的天然纳米药物，具有双重靶向能力，并在LPS/GalN诱导的ALF小鼠模型中验证了其疗效，为这一严重疾病提供了有前景的治疗替代方案。

金莲花是一种传统中药，以其保肝和利胆的特性而闻名。最新的研究表明，金莲花具有良好的抗炎和调节肠道菌群的能力。植物来源的类似外泌体纳米囊泡（PELNVs）是一种具有多种活性成分的生物活性材料，如蛋白质、脂质、小RNA等。研究表明，PELNVs的疗效可以与原始植物相当，甚至优于原始植物。此外，PELNVs不仅克服了传统纳米药物在生物安全性和制备过程上的缺陷，还表现出比动物来源的类似外泌体纳米囊泡更高的产量和更好的生物相容性。更进一步，PELNVs已在多种动物模型中显示出治疗效果。例如，柠檬来源的外泌体可加速糖尿病伤口愈合，而鱼腥草来源的外泌体可有效缓解结肠炎，人参来源的外泌体在胶质瘤治疗中也表现出潜力。此外，PELNVs由于其对胃肠道恶劣条件的耐受性，显示出更优的口服适用性。近期研究表明，口服给药的PELNVs可以在肠道中持续较长时间，从而通过调节肠道菌群对肝脏疾病产生治疗效果。

因此，我们从干金莲花中提取了类似外泌体的纳米囊泡，并在LPS/GalN诱导的ALF模型中验证其疗效。研究首次证明，HNVs能够抑制由肠道来源和外源性LPS引起的肝损伤，从而抑制肝脏的免疫炎症反应，最终改善ALF。

在HNVs的制备和表征部分，我们使用了磷酸盐缓冲液（PBS）对干金莲花进行浸泡，并通过组织均质器进行充分均质化。均质液经离心后，沉淀物被去除，重复该过程直到上清液中不再有肉眼可见的沉淀物。将多次离心后的上清液合并，作为样品进行后续纯化处理。这些样品被注入Unique AutoTFF075-M交叉流过滤系统，并依次通过200 nm孔径和750 kDa分子量截断的中空纤维柱进行分层分离。最终收集的粒径≤200 nm且粒径>750 kDa的样品被定义为HNVs。使用BCA蛋白浓度试剂盒测量HNVs的蛋白浓度，并将HNVs重新悬浮于双蒸水中，通过动态光散射（DLS）测量其粒径和Zeta电位。透射电镜和冷冻电镜被用于研究其形态。

在评估HNVs在胃肠道模拟液中的稳定性时，我们将HNVs悬浮于人工模拟胃液和人工模拟肠液中，调整至0.1 mg/mL的最终浓度。在37°C下孵育两小时后，使用透射电镜和动态光散射对HNVs的形态和粒径进行表征。结果显示，HNVs在不同模拟液中的粒径分布分别为158.5 nm、147.4 nm和164.5 nm，并且在孵育两小时后仍能保持球形结构，这表明HNVs具有良好的稳定性。

为了验证HNVs的生物安全性，我们对BALB/c小鼠（6-8周龄）进行了分组处理，分别给予不同剂量（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）的HNVs和PBS作为对照。每天给予一次口服处理，持续五天，记录小鼠体重变化。在实验结束时，所有小鼠被安乐死，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和血清样本。结果表明，不同剂量的HNVs处理组与PBS对照组在体重变化、肝功能和肾功能指标上均无显著差异，这表明HNVs在生物医学应用中具有良好的安全性。

在体内分布实验中，我们首先将DIR（一种荧光标记物）与HNVs在37°C下孵育30分钟，然后将其转移至超滤离心管中进行离心处理。上层溶液被鉴定为DIR标记的HNVs。将12只小鼠随机分为两组，每组6只。模型组接受LPS（100 μg/kg）和GalN（700 mg/kg）的腹腔注射，而对照组接受PBS注射。一小时后，每只小鼠分别给予50 mg/kg的HNVs口服处理。在指定时间点，将小鼠解剖，获取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肠道组织样本。通过动物成像系统，我们观察到DIR标记的HNVs在对照组和模型组中的分布情况。结果表明，HNVs能够被模型组小鼠摄入，并在两小时后进入肠道，随后逐步进入肝脏，四小时后在肝脏中达到最大积累。而在对照组中，HNVs虽然也进入肠道，但无法进入肝脏，这可能与模型组小鼠的肠道屏障受损有关。

在肝组织的RNA测序分析中，我们发现HNVs能够显著调控肝脏的转录组变化。与LPS/GalN组相比，HNVs组中599个基因显著上调，641个基因显著下调。通过热图分析，我们进一步验证了这一结果。根据KEGG富集分析，HNVs通过参与调控多种炎症免疫通路，如趋化因子信号通路、MAPK信号通路和TNF-α信号通路，从而改善ALF。同时，GO富集分析表明，HNVs能够上调多种生物过程，如细胞修饰氨基酸分解代谢等。同时，HNVs还能够下调如趋化因子介导的信号通路、对白细胞介素-1的反应以及趋化因子受体结合、MAP激酶磷酸酶活性、趋化因子受体活性、趋化因子结合等分子功能。

为了进一步探讨HNVs对M1型极化细胞和趋化因子募集的抑制作用，我们使用流式细胞术分析了LPS/GalN+HNVs组和LPS/GalN组中肝脏组织的M1型和M2型细胞比例。定量分析显示，LPS/GalN显著上调了M1型细胞的表达，而HNVs能够显著下调该表达。此外，LPS/GalN引起的M2型细胞表达显著降低，这一趋势被HNVs逆转。通过免疫荧光染色，我们确认了HNVs能够阻止巨噬细胞向M1型极化，并促进向M2型极化。定量分析显示，HNVs能够显著抑制LPS/GalN引起的肝脏组织中M1型细胞的表达，并显著上调M2型细胞的表达。同时，通过实时定量PCR分析了肝脏组织中趋化因子及其受体的表达情况，结果表明，HNVs能够有效逆转LPS/GalN引起的趋化因子和受体的表达变化，从而抑制免疫炎症反应。

在探讨HNVs对炎症反应的影响时，我们通过Western blot和免疫荧光染色分析了肝脏组织中的自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白。结果显示，LPS/GalN显著上调了P62蛋白的表达，并伴随着Atg5和Atg7蛋白的表达下降，而HNVs能够显著逆转这一趋势，表明HNVs能够通过促进自噬来保护肝脏免受ALF的损害。同时，凋亡被认为是ALF的显著病理特征。Western blot结果表明，LPS/GalN显著增加了肝脏组织中P53蛋白的表达，而HNVs能够逆转这一趋势。通过TUNEL染色，我们分析了肝脏组织的凋亡情况，并发现HNVs能够显著减少LPS/GalN引起的TUNEL表达。此外，通过ELISA检测了各组小鼠血清中的炎症因子表达，结果显示HNVs能够显著降低IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。进一步通过实时定量PCR检测了肝脏组织中的炎症因子表达，结果与血清检测一致，表明HNVs能够有效逆转LPS/GalN引起的炎症因子表达升高。

在探讨HNVs对LPS/GalN诱导的肠道菌群改变的调节作用时，我们发现ALF通常伴随着肠道菌群的失衡，这进一步破坏了肠道屏障，使得肠道来源的LPS通过门静脉进入肝脏，引发一系列免疫炎症反应，从而加剧ALF。因此，我们使用了16S rRNA分析来评估各组肠道菌群的组成变化。通过Upset和Venn图，我们发现三个组共享425个相同的扩增子序列变异（ASVs），而LPS/GalN+HNVs组中存在938个ASVs。为了评估各组肠道菌群的α多样性，我们使用了Ace、Chao、Shannon和Simpson指数，但这些指数在各组之间没有显著差异。通过主坐标分析（PCOA）和Bray Curtis及加权UniFrac方法，我们分析了各组肠道菌群的β多样性，结果表明HNVs治疗使肠道菌群的组成显著接近对照组，并显著远离LPS/GalN组的肠道菌群组成。进一步分析了各组肠道菌群的相对丰度，结果显示LPS/GalN组中Lactobacillus和Bacillus的相对丰度显著下降，而HNVs治疗显著逆转了这一趋势。此外，Lactobacillus和Bacillus可能与肠道屏障修复有关。因此，HNVs能够调节ALF小鼠中紊乱的肠道菌群，从而修复受损的肠道屏障，阻止肠道来源的LPS进入肝脏，进而抑制免疫炎症反应。

本研究中，我们提出了HNVs在ALF小鼠模型中可能通过双重机制发挥保护作用：一方面，HNVs通过调节肠道菌群和修复肠道屏障功能，减少肠道来源的LPS向肝脏的泄漏；另一方面，HNVs能够通过受损的肠道屏障进入肝脏，并直接抑制外源性LPS引起的肝损伤。

综上所述，我们开发了一种天然来源的纳米药物HNVs，并在LPS/GalN诱导的ALF小鼠模型中验证了其显著的治疗效果。基于其良好的生物安全性、优异的口服稳定性和明确的治疗机制，HNVs在临床转化方面展现出良好的前景。未来的研究将集中在开发其符合GMP标准的生产工艺、优化不同的给药策略（尤其是口服给药的临床转化路径）以及进行更深入的长期安全性评估，以加快其在临床应用的进程。此外，鉴于ALF的高死亡率和现有有效治疗手段的局限性，HNVs作为安全、有效且可口服的治疗药物的成功开发和转化，有望为ALF患者提供新的治疗选择，并显著改善其生存率和生活质量，这对维护人类肝脏健康具有潜在的重要性。

然而，本研究仍存在一些不足之处。ALF是一种由多种因素引起的临床综合征，但本研究仅使用了LPS/GalN诱导的ALF模型来评估HNVs的作用。未来需要建立多种ALF模型，以全面评估HNVs在ALF中的广泛适用性。