综述：纳米技术驱动的骨肉瘤治疗进展：免疫疗法与药物递送策略

《International Journal of Nanomedicine》：Nanotechnology-Driven Strategies in Osteosarcoma Advances in Treatment: Immunotherapy and Drug Delivery

本综述系统阐述了纳米材料在骨肉瘤（OS）治疗中的前沿进展，重点聚焦其通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以增强免疫疗法（如免疫检查点阻断、CAR-T）疗效，以及作为多功能靶向递送平台实现化疗药物（如DOX）的精准投递，为克服OS治疗瓶颈提供了创新性纳米技术策略。

　　

Abstract

骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有高度侵袭性和转移潜能，约占所有原发性恶性骨肿瘤的56%。虽然新辅助化疗联合手术仍是标准疗法，但仍面临挑战：手术切缘不理想、药物生物分布非特异性以及全身毒性。纳米材料工程提供了变革性的多功能平台，整合了仿生靶向、刺激响应性释放和治疗诊断功能，以增强肿瘤穿透并减少脱靶效应。免疫疗法通过激活抗肿瘤免疫、重编程免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以及与检查点抑制剂/细胞疗法协同作用来对抗OS。配体功能化的纳米载体显著提高了化疗药物的生物利用度和靶向性。本综述系统探讨了纳米平台在骨肉瘤治疗中的双重作用：（1）通过TME重编程进行免疫治疗；（2）通过先进的药物递送范式实现精准肿瘤学，为克服当前治疗瓶颈并最终改善OS患者临床结局的转化潜力提供了关键见解。

Introduction

骨肉瘤（OS）是一种恶性骨肿瘤，其特征是肿瘤细胞能直接产生骨样组织，更易发生肺转移，且预后不良。OS虽然在绝对意义上罕见（年发病率：每百万人3-4例），但占原发性恶性骨肿瘤的56%，在青少年和年轻成人中发病率显著较高（发病高峰：10-30岁）。目前OS的标准治疗主要包括手术治疗、化疗和术后化疗。尽管OS治疗取得了一些进展，但转移和复发患者的预后仍然很差。

近年来，纳米医学的发展和应用克服了传统治疗方法的副作用，已成为临床医学治疗的关键趋势。创新性双功能纳米平台的开发，整合了靶向递送以增强药物在肿瘤组织内的特异性积累同时最小化对正常组织的暴露和全身毒性，以及免疫调节以保护不稳定的核酸或蛋白质免疫药物免受酶降解，从而显著提高生物利用度并最终增强免疫疗效，代表了癌症治疗的关键进展。

本文综述了纳米材料在OS治疗中的免疫调节和靶向药物递送作用，并简要介绍了OS的免疫微环境、免疫疗法和当前治疗策略。纳米技术的进步有望提高治疗的有效性和安全性，为改善癌症治疗同时最大限度减少副作用提供了有前景的途径。

Osteosarcoma

OS是青少年中常见的恶性骨肿瘤，其特征是肿瘤细胞能直接产生骨样组织。OS主要发生在长骨干骺端，尤其是股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。OS的症状多样且进行性发展。早期，疼痛通常是首发症状。随着肿瘤生长突破皮质并侵犯软组织，会出现明显肿胀。此外，患者可能出现活动障碍，严重者甚至无法行走。肿瘤细胞可破坏软骨组织，使骨骼变脆，易发生病理性骨折。在OS晚期，患者除了局部症状（如严重骨痛、病理性骨折和可触及肿块）外，常表现出特征性的全身表现，如因感染导致的持续发热、显著体重减轻和深度疲劳。

Tumor Microenvironment

OS的肿瘤微环境是指围绕肿瘤细胞的生物学环境，包括细胞、基质、血管、免疫细胞及其他因素的综合作用。肿瘤微环境通过控制肿瘤生长、转移和耐药性在OS的发病机制中起关键作用，使得仅靶向OS细胞无法进一步提高治疗效果。因此，肿瘤学研究的焦点已从狭隘地关注肿瘤细胞转向更广泛地理解肿瘤微环境。

Cellular Components

OS微环境是一个通过持续的细胞间通讯 orchestrated 的复杂动态生态系统，这对肿瘤进展、转移和治疗反应至关重要。这种细胞成分间的交叉对话不仅驱动免疫逃逸和支持肿瘤存活，也蕴含抗肿瘤机制，使其成为疾病行为和治疗结果的核心决定因素。关键的细胞相互作用包括：促肿瘤效应：间充质干细胞（MSCs）通过IL-6/STAT3驱动转移；癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过SDF-1α/MMP-1促进侵袭；M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）/N2型肿瘤相关中性粒细胞（TANs）通过血管内皮生长因子（VEGF）/IL-8介导免疫抑制和血管生成；髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）通过TGF-β/IL-10抑制T细胞活性；循环肿瘤细胞（CTCs）通过外泌体miRNAs（如miR-21）传播耐药性。抗肿瘤潜力：活化的树突状细胞（DCs）增强CD8⁺ T细胞毒性（IFN-γ/GZMB）；N1-TANs通过TRAIL诱导凋亡；自然杀伤细胞（NK细胞）通过NKG2D依赖性裂解靶向OSCs，尽管受PD-L1/IL-10抑制。双重作用：B细胞发挥抗体依赖性肿瘤杀伤（IgG介导的ADCC），但也可能分泌IL-6/TGF-β促进纤维化。靶向关键节点（如STAT3, PD-L1）或采用组合免疫疗法（如DC疫苗，NK细胞过继转移）可能有助于恢复微环境平衡。

Myeloid Cells

在髓系来源的免疫细胞中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是最重要的成员之一。TAMs主导OS免疫景观（>50%的浸润细胞）并表现出功能可塑性。根据不同的激活途径，TAMs分为两种表型：经典激活的巨噬细胞（M1）和替代激活的巨噬细胞（M2）。其中，M1可被脂多糖（LPS）、IFN-γ或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）激活，高表达白细胞介素IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），表现出促炎、免疫原性和抗肿瘤特性。M2型可被IL-4和IL-13激活，产生TGF-β、IL-10和血管生成因子，具有抗炎和促肿瘤作用。恶性肿瘤细胞可分泌促进M2极化的细胞因子，如IL-10，将单核细胞招募到肿瘤区域并促进其分化为M2型巨噬细胞，通过分泌细胞因子、趋化因子和生长因子促进癌细胞的潜伏、生长和转移，并与某些恶性肿瘤的不良预后相关。

在OS中，DCs主要包括三个簇：常规1型DCs（cDC1）（XCR1⁺CLEC9A⁺）、常规2型DCs（cDC2）（CD1C⁺CLEC10A⁺）和成熟调节性DCs（mreg DCs）（CD83⁺CCR7⁺LAMP3⁺）。其中，mreg DCs特异性地存在于OS中，表达CCR7、CCL17、CCL19和CCL22以招募各种类型的浸润T细胞。此外，研究发现mreg DCs可能通过招募OS微环境中的调节性T细胞（Tregs）来促进肿瘤免疫耐受。DCs通过检测肿瘤抗原并将其呈递给辅助T细胞和细胞毒性T细胞来触发进一步的免疫反应，在此过程中它们从未成熟DCs转变为成熟DCs。因此，在早期，DCs积极增殖和成熟以激活辅助T细胞和细胞毒性T细胞。在肿瘤生长过程中，OS细胞产生对DCs和吞噬细胞耐药的变异体，导致DC活化减弱并最终发生免疫逃逸。

肿瘤相关中性粒细胞（TANs）大致分为抗肿瘤（N1）和促肿瘤（N2）亚型。N1 TANs通过活性氧（ROS）介导的细胞毒性参与肿瘤细胞杀伤，并可能参与抗原呈递。相反，N2 TANs通过分泌MMP-9和VEGF等因子促进肿瘤进展。中性粒细胞可通过与其他免疫细胞的相互作用参与OS的发展。它们通过分泌IL-37、CCL2和CCL3招募单核细胞。研究表明，被招募的单核细胞和巨噬细胞可能通过释放CXCL8进一步吸引中性粒细胞。此外，TANs可释放ROS、活性氮物种（RNI）和前列腺素E₂（PGE2）等物质，直接抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤作用。中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是由中性粒细胞分泌的颗粒蛋白和染色质形成的网状结构。这些可以激活休眠的癌细胞，增强癌细胞的迁移和侵袭能力，诱导肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT），并捕获循环癌细胞以促进其转移。

髓源性抑制细胞（MDSCs）源自骨髓造血干细胞，是DCs、巨噬细胞和粒细胞的 precursors，表现出强大的免疫抑制活性。在肿瘤微环境中，MDSCs表达免疫检查点分子，如PD-L1，抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性，并分泌免疫抑制因子如IL-10和TGF-β，以促进其他免疫抑制细胞的分化，包括Tregs、M2巨噬细胞和MDSC，从而形成广泛的免疫抑制网络。此外，MDSCs还通过产生VEGF和FGF2促进血管生成，为肿瘤生长提供营养。研究表明，MDSCs还产生IL-6和TGF-β，这些细胞因子刺激癌细胞发生EMT，并分泌基质金属蛋白酶（MMPs），促进癌细胞的侵袭和转移。

Lymphoid Cells

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）主要分布在表达人类白细胞抗原I类的区域，而CD4⁺和CD8⁺ T细胞主要集中在肺转移灶与正常组织的交界处。转移灶中的T细胞数量显著高于原发灶和复发灶。同时，一些T细胞可能在OS微环境中发挥抗肿瘤作用，尤其是CD8⁺ T细胞，它们能够识别并杀死肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长和增殖。Casanova等人的研究揭示，肿瘤浸润CD4⁺细胞的存在为OS患者提供了保护，而CD8⁺细胞对患者的总生存期和无进展生存期（PFS）有显著影响。一些Tregs可能抑制免疫细胞对肿瘤的攻击，从而促进肿瘤生长和逃避免疫监视。

NK细胞具有识别和杀死肿瘤细胞的先天能力，在OS微环境中发挥重要作用。作为一组异质性的先天效应细胞，NK细胞表现出一系列抗肿瘤效应，包括细胞裂解和细胞因子产生。然而，肿瘤微环境通常对免疫细胞产生一定程度的抑制，这可能包括削弱NK细胞的活性或逃避其识别。一些研究表明，OS患者的NK细胞活性可能受到抑制，这可能与肿瘤微环境中的免疫逃逸机制有关。NK细胞的细胞毒性由其受体介导的激活和抑制信号的复杂相互作用精确控制。NK细胞通过直接与肿瘤细胞相互作用或分泌细胞因子和趋化因子来调节适应性免疫，从而参与抗肿瘤免疫，控制肿瘤生长。

虽然NK细胞和CD8⁺ T淋巴细胞都具有消除恶性细胞的细胞毒性能力，但它们的功能协同受到相互免疫调节机制的限制，这些机制平衡了肿瘤监视和免疫稳态。此外，NK细胞分泌的IFN-γ刺激CD4⁺ T细胞的激活，这是CD8⁺ T细胞前体增殖所必需的。

Non-Immune Cells

肿瘤微环境中的MSCs分为初始间充质干细胞（MSCs）和肿瘤来源的间充质干细胞（T-MSCs）。初始MSCs可以促进或抑制肿瘤进展，而受肿瘤微环境影响的T-MSCs则倾向于促进肿瘤进展。OS与MSCs之间存在复杂而密切的关系。由于MSCs具有多向分化潜能，它们在响应致瘤因子时容易发生基因突变和异常分化，从而引发OS发展。

MSCs critically influence OS增殖和转移。OS衍生因子（如SDF-1, IL-6, PDGF）将MSCs招募到肿瘤部位。OS细胞与MSCs之间的双向IL-8信号环路增强了它们相互的IL-8表达，促进了OS的侵袭和转移。此外，与骨髓来源的MSCs（BM-MSCs）的相互作用上调了OS细胞中的水通道蛋白-1（AQP1），促进了BM-MSCs诱导的迁移/侵袭。肿瘤驻留的BM-MSCs在与OS细胞相互作用后可分化为癌症相关成纤维细胞（CAFs），显著增强了OS的增殖、迁移和侵袭。

Exosomes

OS微环境中存在的细胞外囊泡（EVs），包括外泌体，携带生物活性分子（如miRNAs、蛋白质、细胞因子），调节肿瘤微环境内的细胞信号和功能。其中，外泌体是细胞间通讯的关键媒介。细胞控制外泌体中的物质，并具有改变自身或其他细胞命运的作用。作为宿主细胞的卫星，外泌体包含大量生物信息，包括蛋白质、脂质和遗传物质。它们的功能超出了最初的预期，参与调节各种细胞功能和疾病状态。癌细胞通常比正常细胞产生更多的外泌体。这些外泌体是肿瘤细胞与微环境相互通讯的关键介质。它们具有强大的重塑局部和远端微环境的能力，从而显著影响肿瘤的发展和转移。研究表明，TME中外泌体携带的癌细胞来源的miR-21可以影响癌细胞和周围的基质成分，包括免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。miR-21的多个靶基因通过增强癌细胞可塑性参与OS的肿瘤进展、转移、血管生成和免疫逃逸。

Angiogenesis

OS微环境中的血管生成是指肿瘤周围血管网络的形成。OS中的血管生成是一个涉及肿瘤细胞、血管内皮细胞、基质细胞和多种生长因子相互作用的复杂过程。OS肿瘤细胞分泌一系列促血管生成因子，如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和TGF-β，这些因子刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，导致新血管生成。此外，炎症细胞释放的细胞因子和化学介质可以诱导TME中血管内皮细胞的激活和血管生成。总的来说，OS微环境中的血管生成是肿瘤生长和转移的关键因素。理解这一过程对于制定OS的治疗策略具有重要意义。

Current Therapeutic Frontiers in Osteosarcoma

目前OS治疗结合手术和化疗，但化疗耐药和全身毒性限制了其疗效。基于免疫的疗法通过靶向肿瘤特异性免疫逃逸机制，实现了优于传统疗法的肿瘤控制效果，且脱靶效应更小。

Surgery and Chemotherapy

手术（保肢或截肢）仍然是OS综合治疗不可或缺的一部分。对于高级别非转移性OS，当达到足够切缘时，保肢手术和截肢术的生存率和局部复发率相当，但保肢手术提供了更好的功能结果。新辅助化疗反应者是保肢手术的最佳候选者，如果可以实现广泛的切除边缘。截肢术适用于解剖位置不利、无法充分切除的肿瘤。化疗（辅助/新辅助）显著改善了局限性OS的预后。早期方案联合使用了多柔比星、顺铂、博来霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、达克珠单抗和大剂量甲氨蝶呤等药物。对于转移性OS，初始管理与非转移性疾病相似：新辅助化疗后切除原发肿瘤和所有转移部位。

Tumor Immunotherapy

自从引入化疗以来的过去40年里，OS患者的生存率没有显著提高，目前的二线治疗效果有限。这种治疗困境可能源于将高度异质性的OS视为单一疾病并应用相同的治疗方案。因此，迫切需要新的治疗方法。免疫疗法作为一种对该疾病有益的新疗法，正受到越来越多的关注。

Immune Checkpoint Blockade Therapy

OS的免疫检查点疗法是一种利用抑制免疫系统攻击癌细胞的抑制机制的治疗方法，通常通过使用抗体阻断肿瘤细胞上的免疫抑制信号，从而激活患者自身的免疫系统攻击和消除肿瘤细胞。在OS中，免疫检查点疗法的主要目标是通过抑制免疫抑制信号来激活患者的T细胞和其他免疫细胞，并增强它们攻击肿瘤细胞的能力。常用的免疫检查点包括：（1）PD-1/PD-L1抑制剂：PD-1（程序性死亡-1）是表达在活化T细胞上的免疫检查点分子，与其配体PD-L1结合。PD-L1通常由肿瘤细胞过表达，并与PD-1结合，从而抑制T细胞介导的免疫反应。除了T细胞，PD-1也在各种免疫细胞上表达——NK细胞和B细胞——其与肿瘤源性PD-L1的相互作用传递抑制信号，抑制免疫活性。PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断这种相互作用起作用，从而恢复抗肿瘤T细胞活性。Dhupkar等人证明PD-1抑制剂在鼠模型中阻碍OS转移。这种效应与巨噬细胞从M2表型向M1表型的转变有关，这可能是由重新激活的T细胞释放的IFN-γ介导的。基于这一发现，Ge等人将可生物降解的镁棒（在交变磁场下充当热磁剂）与PD-L1抑制剂结合，实现了OS的完全缓解。（2）CTLA-4抑制剂：CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4）是另一个重要的免疫检查点分子，它通过与配体竞争性结合来抑制T细胞的初级激活。它主要通过与CD28竞争抗原呈递细胞（APCs）上的配体CD80和CD86来发挥抑制作用。此外，CTLA-4还增强Tregs的免疫抑制功能，同时抑制辅助T细胞（Th）的活性。CTLA-4抑制剂阻断CTLA-4介导的信号传导，促进T细胞活化和增殖，并增强抗肿瘤免疫反应。

然而，在OS中，免疫抑制性微环境限制了单药免疫检查点抑制剂（ICIs）的疗效，促使人们探索联合策略，主要是抗PD-1/PD-L1与抗CTLA-4抗体联合。临床前研究表明，抗PD-L1单药治疗可诱导代偿性CTLA-4上调，驱动耐药性，而联合疗法可以克服这一点。临床证据包括一份病例报告，其中纳武利尤单抗（抗PD-1）联合伊匹木单抗（抗CTLA-4）控制了转移性OS，生物标志物分析表明患者选择的重要性；以及试验表明联合疗法的缓解率优于纳武利尤单抗单药治疗。因此，双重检查点阻断代表了一种治疗晚期、难治性OS的有前景的方法，尽管需要仔细管理毒性。

免疫检查点疗法在各种癌症类型中取得了显著的临床结果，并已成为主要治疗选择。然而，免疫检查点疗法在OS治疗中的应用仍处于研究和临床试验阶段。尽管如此，免疫检查点疗法可能为晚期或复发性OS患者提供新的治疗选择，并且正在积极进行临床研究以评估其安全性和有效性。

Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy

肿瘤细胞可能下调其自身HLA和肿瘤抗原的表达，从而无法被T细胞识别。工程化T细胞对肿瘤特异性抗原具有高亲和力，并且可以在没有HLA呈递背景的情况下识别肿瘤细胞。这种T细胞称为嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）。T细胞可以通过由α和β链组成的TCR识别抗原，但αβ-TCR只有在抗原以8-11个氨基酸长肽的形式存在时才能识别响应抗原，这表明人类T细胞识别肿瘤抗原的条件苛刻。与TCR不同，CAR分子不需要MHC即可直接识别并结合细胞表面表达的目标分子。CAR分子是一种合成的融合蛋白，由识别目标抗原的胞外域、铰链区、跨膜域和胞内信号域组成。首先，需要从肿瘤患者的外周血中收集、分离和纯化T细胞，然后使用病毒载体将CAR分子的基因构建体插入T细胞基因组，使T细胞在其表面表达CAR分子。由此产生的CAR-T细胞在体外扩增（通常需要达到数百万到数十亿倍的数量级）并回输给患者。

与血液肿瘤相比，CAR-T疗法在实体瘤中识别合适的CAR靶点并克服这些肿瘤中的免疫抑制性肿瘤微环境方面更具挑战性。作为一个潜在靶点，研究人员分析了OS细胞系中免疫检查点B7-H3的表达，并评估了与FITC偶联的抗B7-H3单克隆抗体（anti-B7-H3-FITC mAb）控制抗FITC CAR-T细胞抗肿瘤活性的能力；靶向B7-H3的CAR-T细胞在体外显示出强大的B7-H3特异性肿瘤细胞杀伤能力，并在体内的PDX模型中显示出显著的肿瘤抑制，显示了其在未来临床试验中治疗OS的巨大潜力。进一步证明在OS中的功能潜力，CD70特异性CAR T细胞成功通过受限的3D微通道网络迁移，并通过趋化性表现出抗OS的活性，其疗效取决于效应子与靶标的比率。在OS中，CAR-T细胞疗法可能是一种有效的策略，因为原发性骨肿瘤通常表现出低突变负荷，并伴有罕见的天然抗肿瘤T细胞。

Tumor Vaccine

肿瘤疫苗是一种免疫治疗方法，旨在通过暴露肿瘤抗原来诱导人体免疫系统的抗肿瘤反应。这些疫苗可以包括体外培养的癌细胞、肿瘤相关抗原或免疫细胞，然后将其注射给患者。治疗目标是通过重新激活针对肿瘤相关抗原的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）来重振免疫监视，从而克服免疫逃逸机制并诱导肿瘤特异性细胞毒性以控制或根除肿瘤生长。目前，最成熟的肿瘤疫苗技术是宫颈癌疫苗。宫颈癌的发病主要由人乳头瘤病毒（HPV）诱导，因此宫颈癌疫苗分为预防性疫苗（针对HPV感染）和治疗性疫苗（暴露肿瘤抗原）。树突状细胞（DCs）作为专业的抗原呈递细胞，可以激活CTLs并增强其增殖。作为肿瘤疫苗接种策略的基石，DC疫苗已被用于多种恶性肿瘤，以根除化疗耐药性肿瘤中的恶性细胞；值得注意的是，它们的卓越性在OS应用中最突出。肿瘤疫苗也显示出作为OS个体化免疫治疗策略的潜力。它们可以通过引导人体免疫系统识别和攻击肿瘤细胞来刺激肿瘤特异性免疫反应。肿瘤疫苗主要分为免疫细胞疫苗和非细胞疫苗。在这些类型中，基于免疫细胞的疫苗利用先天免疫细胞来激活效应T淋巴细胞。然而，一个重大挑战在于调节迁移和激活，因为这些过程受到肿瘤微环境中免疫抑制物质以及患者免疫效应细胞数量和质量的影响。

Oncolytic Virus

溶瘤病毒已成为参与肿瘤治疗的重要免疫疗法。经过多年研究，溶瘤病毒疗法发展迅速。已有十多种病毒，包括疱疹病毒、肠道病毒和痘苗病毒，被开发成溶瘤病毒药物并进入临床试验。溶瘤病毒可以选择性地在肿瘤细胞中复制，并在TME内引发病毒特异性或肿瘤特异性炎症反应。

Nanomaterial-Based Immunotherapy in Osteosarcoma

Innate Immune Cell Mediated Strategies

先天免疫细胞，包括巨噬细胞和DCs，通过重塑肿瘤微环境来 orchestrate OS进展。将TAMs重极化和增强DCs的抗原呈递都与PD-1/PD-L1阻断协同作用；然而，这些细胞的代谢异质性和免疫耐受生态位需要进一步的机制研究以促进临床转化。

Tumor-Associated Macrophages

目前对OS微环境中TAMs的研究主要集中