多聚泛素化跨膜蛋白通过竞争网格蛋白包被囊泡有限空间优先内化的机制研究

《Cell Reports》：Poly-ubiquitylated transmembrane proteins outcompete other cargo for limited space inside clathrin-coated vesicles

本研究针对跨膜蛋白在内吞过程中如何基于泛素化状态进行选择性分选的科学问题，开展了关于多聚泛素化调控网格蛋白介导内吞作用的研究。研究人员通过构建不同泛素化程度的模型跨膜蛋白，发现多聚泛素化能显著提高内吞结构稳定性和货物装载容量，使高度泛素化蛋白在竞争中胜出。这项研究揭示了细胞通过泛素化依赖性竞争机制优先清除损伤蛋白的新范式，对理解膜蛋白质量控制具有重要意义。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，跨膜蛋白的循环利用犹如一场精妙的分子舞蹈。这些镶嵌在细胞膜上的蛋白质需要不断通过内吞作用进入细胞内部，完成信号传导、营养物质摄取等重要功能后，再被送回细胞表面。其中，网格蛋白介导的内吞作用(CME)是最主要的内吞途径，它通过形成特殊的网格蛋白包被囊泡来选择性包裹特定跨膜蛋白。然而，细胞膜上蛋白质密度极高，而内吞囊泡的空间有限，这就产生了一个关键科学问题：细胞如何决定哪些蛋白优先进入这个"分子电梯"？

近年来，科学家发现泛素化——一种在蛋白质上添加泛素分子的化学修饰——可能扮演着"优先通行证"的角色。当跨膜蛋白细胞内结构域被泛素化后，它们更容易被内吞装置识别。但悬而未决的是，单个泛素修饰(单泛素化)和多个泛素形成的链状结构(多聚泛素化)究竟哪种更能促进内吞？更重要的是，在拥挤的细胞膜环境中，高度泛素化的蛋白是否会"挤占"其他蛋白的内吞机会？这些问题对理解细胞如何选择性清除损伤或老化蛋白至关重要，因为异常蛋白往往会被标记上多聚泛素链。

为了解开这些谜团，德克萨斯大学奥斯汀分校的Jeanne C. Stachowiak团队在《Cell Reports》上发表了他们的最新发现。研究人员巧妙地设计了一套实验体系，通过在人类乳腺上皮细胞(SUM159)中表达工程化的跨膜蛋白，直接比较了不同泛素化状态对内吞效率的影响。

研究团队运用了多项关键技术：通过分子工程构建了具有确定泛素化数目(0、1或4个泛素)的转铁蛋白受体(TfR)嵌合体；利用 spinning disk confocal microscopy 和全内反射荧光显微镜(TIRF)进行活细胞动态成像；采用CMEAnalysis算法定量分析蛋白质在内吞结构中的定位；通过流式细胞术测量配体内吞效率；以及建立竞争性内吞实验模型评估不同泛素化状态蛋白的竞争优势。

多聚泛素化增强模型跨膜蛋白的内吞摄取

研究人员首先设计了三种模型蛋白：无泛素修饰的0-Ub、单泛素化的1-Ub和四泛素化的4-Ub。这些蛋白均包含TfR的细胞内和跨膜结构域，以及用于可视化的红色荧光蛋白(RFP)。通过定量分析发现，随着泛素化程度增加，蛋白质在内吞结构中的饱和容量显著提高——4-Ub比0-Ub增加了3.3倍，1-Ub比0-Ub增加了2.1倍。同时，蛋白质与内吞结构的结合亲和力也随泛素化增强而提高，表明多聚泛素化通过多价相互作用增强了与内吞适配体蛋白的结合。

多聚泛素链长度调控模型受体的配体摄取

为了验证泛素化对功能性的影响，研究团队构建了能结合绿色荧光蛋白(GFP)的模型受体。流式细胞术分析显示，与0-Ub受体相比，1-Ub和4-Ub受体的GFP摄取量分别提高了2.6倍和4.8倍，证明泛素化增强的内吞定位确实转化为更高的配体内吞效率。

多聚泛素化提高内吞结构稳定性

通过TIRF显微镜实时追踪内吞过程，研究人员发现多聚泛素化能显著改变内吞结构的命运。与0-Ub相比，4-Ub模型蛋白使"短命"的流产性内吞结构减少，而"生产性"成功形成囊泡的结构增加了22%。同时，4-Ub蛋白在早期内体标志物EEA1阳性结构中的富集程度更高，表明多聚泛素化不仅促进内吞起始，还增强向内体的运输效率。

多聚泛素化模型跨膜蛋白在竞争中胜出

最令人瞩目的发现来自竞争实验。当非泛素化的"旁观者"蛋白与泛素化的"竞争者"蛋白共同表达时，随着竞争者泛素化程度增加，旁观者蛋白在内吞结构中的定位显著减少。定量分析表明，4-Ub竞争者的存在使旁观者蛋白的内吞饱和容量降低了1.6倍，证明多聚泛素化蛋白确实能抢占内吞囊泡中的有限空间。

多聚泛素化模型受体在配体摄取中胜出

在功能性竞争实验中，研究人员观察到了相同趋势：当非泛素化受体与泛素化竞争者共同存在时，随着竞争者泛素化程度增加，非泛素化受体的配体摄取量显著降低。4-Ub竞争者的存在使GFP摄取量减少了2.1倍，进一步证实细胞确实优先内吞高度泛素化的跨膜蛋白及其配体。

这项研究系统性地揭示了多聚泛素化在网格蛋白介导内吞中的核心作用机制。研究表明，多聚泛素化通过两种互补机制优先促进跨膜蛋白内吞：一是通过增强与Eps15、Epsin等含泛素相互作用 motif(UIM)的适配体蛋白结合，稳定内吞结构并提高其成功几率；二是在分子拥挤的膜环境中，多聚泛素化蛋白凭借其多价结合优势竞争性占据内吞囊泡有限空间。

这些发现对理解细胞质量控制机制具有重要意义。考虑到多聚泛素化通常标记损伤或完成功能的蛋白质，这种基于泛素化的竞争性分选机制可能构成细胞选择性清除表面损伤蛋白的核心策略。正常功能蛋白因缺乏多聚泛素化标记而得以保留在膜上，而异常蛋白则被优先内吞降解，这一机制为理解多种疾病状态下膜蛋白稳态失调提供了新视角。

研究的创新之处在于首次在生理相关条件下直接证明了内吞过程中存在的竞争性分选现象，并明确了多聚泛素化相对于单泛素化的优势地位。虽然研究主要使用工程化模型系统，但所揭示的基本原理很可能适用于多种内源性跨膜蛋白的调控。未来研究需要进一步探索不同泛素链类型(如K63连接)的具体作用，以及各种泛素结合适配体蛋白在这一过程中的相对贡献。