BRD3通过TIP60介导的染色质重塑促进转录活跃区R-loop调控的同源重组修复以维持基因组稳定性

《Cell Reports》：BET family BRD3 initiates DSB-induced chromatin remodeling with TIP60 to promote R-loop-mediated HR

本刊推荐：为解决转录活跃染色质区DNA双链断裂(DSB)修复机制不清的问题，研究人员开展BRD3调控同源重组(HR)的机制研究。发现BRD3通过ET结构域招募CHD4，促进TIP60复合体介导的H4K16乙酰化，抑制53BP1募集，从而促进R-loop介导的HR修复。该机制揭示了转录因子在基因组稳定性维持中的新功能，为HR缺陷(HRD)癌症治疗提供新靶点。

　　

在细胞生命活动中，基因转录和DNA修复是两个至关重要的过程。然而，当DNA双链断裂(DSB)发生在转录活跃的染色质区域时，这两个过程就会产生冲突。转录活跃区域通常具有开放的染色质结构，这使其更容易受到DNA损伤的影响。目前，科学界对转录活跃区域的DNA修复机制了解甚少，尤其是如何平衡精确的同源重组(HR)修复和容易出错的非同源末端连接(NHEJ)修复途径。

以往研究发现，同源重组因子如BRCA1、RAD52等会被招募到转录活跃染色质区域，但这些因子如何克服53BP1介导的HR抑制屏障，从而防止基因组不稳定和癌症发生，其机制仍不明确。溴结构域和额外末端结构域(BET)蛋白家族作为重要的转录调控因子，在基因组稳定性维持中发挥作用，但具体成员如BRD3在DNA损伤应答中的直接功能尚不清楚。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，日本东北大学发育衰老癌症研究所的Ayako Ui和Akira Yasui领导的研究团队揭示了BRD3在转录活跃染色质区DSB修复中的关键作用。他们发现BRD3能够启动由CHD4和TIP60介导的染色质重塑，促进R-loop介导的同源重组修复，同时抑制致突变性的NHEJ途径，从而维持基因组稳定性。

研究人员运用了多种关键技术方法：通过激光微辐照和活细胞成像分析蛋白在DSB位点的招募动力学；利用U2OS/TRE/I-Scel-19细胞系统研究转录活跃区域的DNA修复过程；采用免疫共沉淀和质谱分析鉴定BRD3相互作用蛋白；通过同源重组(DR-GFP)和NHEJ(dA3-1)报告系统评估修复效率；使用ASHRA(位点特异性同源重组活性)检测法量化转录活跃位点的HR效率；结合免疫荧光和图像分析技术定量蛋白定位和修饰水平。

BRD3招募BRCA1促进HR同时抑制53BP1和NHEJ

研究人员首先发现BRD3敲低增加了细胞对博来霉素的敏感性，降低了BRCA1灶的形成，但增加了53BP1在DSB位点的积累。通过DR-GFP HeLa细胞系统证实BRD3敲低降低了HR活性，而在H1299 dA3-1细胞中发现BRD3敲低不仅没有降低NHEJ活性，反而增加了NHEJ。这表明BRD3在促进HR的同时抑制了53BP1这一主要的HR拮抗因子。

BRD3的C末端ET结构域响应DSB信号

通过激光微辐照实验，研究人员发现BRD3的C末端ET结构域能够响应DSB信号，而两个溴结构域(N2)虽然定位于细胞核内，但对DSB没有明显响应。当将核定位信号(NLS)与BRD3的C端结构域融合后，该融合蛋白能够在细胞核内定位并积累于DSB位点。

BRD3被招募到转录活跃染色质

利用U2OS/TRE/I-Scel-19细胞系统，研究人员发现Tam诱导转录激活后，磷酸化的Ser2(pS2-RNAPII)和转录活跃组蛋白修饰标志H4K5ac在Cherry位点(TRE位点)增加。GFP标记的BRD3与内源性BRD3一致地定位于转录活跃位点，而仅含有一个溴结构域(N1)或ET结构域(C)的变异体在这些位点的检测信号较弱。

BRD3促进BRCA1和R-loop处理因子RAD52在转录活跃染色质DSB位点的招募

研究发现，在I-Scel转染诱导DSB后，转录活跃染色质区域的R-loop形成增加，BRCA1和RAD52的招募也增强。BRD3敲低降低了BRCA1和RAD52在转录活跃位点的招募，也减少了RAD52在激光微辐照DSB位点的招募。此外，BRD3敲低导致DSB形成后转录活跃位点的R-loop积累增加。

BRD3蛋白相互作用网络的探索

通过免疫共沉淀和质谱分析，研究人员发现BRD3与参与RNA代谢、TP53活性调控和染色质组织的蛋白质相互作用。基因富集和蛋白互作分析显示，BRD3还与p400相关复合物(包括TIP60复合物)的蛋白质以及通过HR正向调控DSB修复的蛋白质相互作用。

BRD3的ET结构域在转录活跃染色质DSB位点招募CHD4

研究发现，在Tam诱导转录激活和I-Scel诱导DSB后，CHD4被招募到转录活跃位点。免疫共沉淀实验证实BRD3通过其ET结构域与CHD4相互作用，且这种相互作用在DSB后增强。BRD3敲低或CHD4的ET结合突变都损害了CHD4在DSB位点的招募。

DSB后BRD3和CHD4招募TIP60使H4K16ac促进转录活跃染色质的HR

研究人员发现，BRD3或CHD4敲低降低了TIP60及其复合物成员MBTD1在激光微辐照DSB位点的招募。同时，BRD3或CHD4敲低也损害了转录活跃位点H4K16ac的形成。通过ASHRA检测法，研究发现BRD3敲低降低了转录活跃位点的HR活性。临床数据分析显示，在无BRCA1/2突变的乳腺癌患者中，低BRD3表达与高HRD评分相关。

研究结论与意义

本研究揭示了BRD3作为转录活跃基因组守护者的新功能。在转录激活期间，BRD3通过其N端溴结构域定位到高度乙酰化的组蛋白上。DSB诱导后，BRD3通过其ET结构域招募CHD4，促进染色质重塑，替换过多的HP1，招募TIP60复合体，导致H4K16ac的富集和MBTD1的招募。这一过程抑制了53BP1的结合，促进了BRCA1和其他R-loop介导的HR因子的招募。

该研究的创新在于发现了转录因子BRD3在DSB修复中的直接作用，阐明了其在转录活跃区域通过调控染色质重塑来平衡HR和NHEJ修复途径的分子机制。这不仅深化了对基因组稳定性维持机制的理解，也为HRD癌症的治疗提供了新的潜在靶点。研究结果表明，BRD3功能缺失可能导致HR缺陷，与乳腺癌的发生发展密切相关，为临床诊断和治疗策略提供了重要理论基础。