斑马鱼成纤维细胞双相调控炎症促进脊髓再生的机制研究

《Cell Reports》：Biphasic inflammation control by fibroblasts enables spinal cord regeneration in zebrafish

为解决哺乳动物中枢神经系统(CNS)损伤后纤维化瘢痕和持续炎症抑制轴突再生的问题，研究人员开展斑马鱼脊髓损伤后成纤维细胞与免疫细胞调控机制研究。通过时序单细胞转录组学发现cthrc1a+成纤维细胞通过Ca2+依赖性方式双向调控中性粒细胞炎症反应，建立具有适宜机械结构特性的损伤微环境，最终促进轴突再生和运动功能恢复。该研究为CNS再生提供了新的治疗思路。

　　

脊髓损伤会导致感觉运动和自主神经功能障碍，在人类和其他成年哺乳动物中，由于断裂的轴突无法跨越损伤部位再生，这些功能障碍会持续存在。持续的炎症和纤维化瘢痕组织的形成——这两个相互交织的过程——是再生失败的关键因素。与哺乳动物形成鲜明对比的是，斑马鱼在中枢神经系统损伤后表现出强大的再生能力。近期研究发现，斑马鱼的免疫反应和成纤维细胞来源的损伤细胞外基质(ECM)能够促进脊髓损伤后的轴突再生，这表明这些过程需要严格的调控控制才能实现再生。

在《Cell Reports》发表的这项研究中，Nora John、Thomas Fleming等研究人员通过时序单细胞转录组学分析，揭示了斑马鱼脊髓损伤后成纤维细胞与先天免疫细胞之间的调控机制。研究发现了一种瞬时的损伤诱导型cthrc1a⁺成纤维细胞状态，这些细胞表现出与炎症相关的低分化、非纤维化特征。这些成纤维细胞通过双相调控炎症的方式，在损伤早期释放促炎因子诱导免疫反应，后期则产生免疫抑制因子促进炎症消退，从而创造有利于再生的微环境。

研究人员运用了多项关键技术方法：通过时序单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析损伤不同时间点的细胞转录组动态；利用转基因斑马鱼系(pdgfrb:GFP, mpx:GFP, mpeg1:GFP等)进行细胞特异性标记和活体成像；采用光遗传学方法(pdgfrb:memKillerRed)进行细胞特异性消融；通过形态寡核苷酸(MO)和CRISPR/Cas9技术进行基因功能缺失研究；结合布里渊显微镜(BM)、原子力显微镜(AFM)和光学衍射断层成像(ODT)等技术分析损伤部位的机械特性。

研究结果：

时间分辨的单细胞转录组学识别反应性成纤维细胞状态

通过scRNA-seq分析，研究人员在7个成纤维细胞样细胞群中鉴定出6个损伤诱导的瞬态群体，其中cthrc1a⁺成纤维细胞表达最高数量的促再生基因。原位杂交证实cthrc1a在损伤后6小时在pdgfrb⁺成纤维细胞中上调表达。

cthrc1a⁺成纤维细胞分化程度较低

RNA速率分析显示cthrc1a⁺成纤维细胞来源于恒定成纤维细胞并最终回归该状态。这些细胞表现出核心基质组基因表达降低27%-38%，包括与哺乳动物CNS瘢痕抑制特性相关的小亮氨酸富集蛋白聚糖、软骨素硫酸蛋白聚糖等基因，表明其处于低分化状态。

cthrc1a⁺成纤维细胞具有炎症相关特征

这些细胞高表达炎症相关分泌因子，特别是NF-κB通路活性显著。通过pdgfrb:IkBSR转基因抑制NF-κB信号会减少轴突桥厚度和游泳距离恢复，表明该信号通路对再生至关重要。

cthrc1a⁺成纤维细胞出现与先天免疫反应同步

scRNA-seq鉴定出2个巨噬细胞/单核细胞(Mφ)和6个中性粒细胞群体，这些群体具有异质性细胞因子表达谱。空间分布分析显示cthrc1a⁺成纤维细胞与Mpeg1⁺ Mφ和Mpx⁺中性粒细胞密切相互作用。时间动态显示cthrc1a⁺成纤维细胞的出现与中性粒细胞2群体同步。

cthrc1a⁺成纤维细胞状态的诱导先于免疫细胞侵袭

活体成像显示pdgfrb⁺间充质细胞2形成复杂网络包裹脊髓。这些细胞表达机械敏感离子通道piezo1，并在损伤后5秒内出现Ca²⁺信号。抑制Ca²⁺信号会减少cthrc1a表达和轴突再生。时间 lapse记录显示第一个中性粒细胞在损伤后454±113秒到达损伤核心，而Mφ在19±7分钟后被检测到。

cthrc1a⁺成纤维细胞诱导先天免疫反应

通过pdgfrb:NTR-mCherry和pdgfrb:memKillerRed系统特异性消融pdgfrb⁺细胞，显著减少了cthrc1a⁺成纤维细胞的形成，并导致中性粒细胞和Mφ在损伤核心的招募减少。LPS诱导的免疫激活可以挽救这种表型，表明替代性免疫信号可以补偿cthrc1a⁺成纤维细胞的缺失。

cthrc1a⁺成纤维细胞控制炎症消退

scRNA-seq分析显示，在成纤维细胞消融的动物中，中性粒细胞向促炎表型转变，Mφ群体中促炎细胞因子表达增加。在炎症高峰期光遗传学消融cthrc1a⁺成纤维细胞导致中性粒细胞在损伤部位滞留增加3.5倍。

Cxcl8、Tgfβ1和Tgfβ3控制中性粒细胞动态

cthrc1a⁺成纤维细胞高表达cxcl8b.1、tgfb1a和tgfb3。通过MO抑制cxcl8b.1减少中性粒细胞招募，而抑制tgfb1a或tgfb3则增加中性粒细胞滞留。这些处理均导致轴突再生和功能恢复受损。

扰乱炎症动态改变机械结构组织特性

使用Cxcr1/2拮抗剂SB225002扰乱中性粒细胞动态后，虽然不影响cthrc1a表达或Mfap4⁺ Mφ招募，但改变了损伤微环境的机械结构特性。CP-OCT显示共偏振比率降低，Rhobo6染色显示ECM模式改变，BM显示布里渊频移增加20 MHz表明压缩性降低，AFM显示表观弹性模量增加1.5倍表明组织硬化。

研究结论与意义：

该研究确立了成纤维细胞双相控制炎症作为中枢神经系统再生的重要机制。在斑马鱼中，成纤维细胞通过Ca²⁺依赖性方式感知损伤，并依次诱导和解决中性粒细胞驱动的炎症反应。早期通过释放Cxcl8等趋化因子招募中性粒细胞，后期通过产生Tgfβ1和Tgfβ等免疫抑制因子促进炎症消退。这种精确的时空调控防止了慢性炎症，建立了具有适宜机械特性的再生许可性微环境。

值得注意的是，斑马鱼的cthrc1a⁺成纤维细胞与哺乳动物的CTHRC1⁺成纤维细胞存在重要差异：前者表现为低分化状态和基质分泌减少，而后者产生高水平ECM蛋白。这种差异可能部分解释了为什么斑马鱼能够成功实现CNS再生而哺乳动物不能。

该研究不仅揭示了炎症调控在组织再生中的核心作用，还为开发促进哺乳动物CNS再生的治疗策略提供了新的思路。通过模拟斑马鱼成纤维细胞的双相炎症控制机制，可能有助于解决哺乳动物CNS损伤后持续炎症和纤维化瘢痕形成的问题，为脊髓损伤等疾病的治疗开辟新的途径。