基于多重生物传感器条形码的FRET信号稳健校准与定量新方法

《iScience》：Robust calibration and quantification of FRET signals using multiplexed biosensor barcoding

本研究针对FRET生物传感器成像中信号校准困难、难以多重化的问题，开发了一种基于条形码技术的稳健校准方法。通过引入FRET-ON和FRET-OFF校准标准，结合理论建模和实验验证，实现了对多种FRET生物传感器信号的同时定量校准，解决了成像参数波动和光漂白对信号解读的干扰，为长期、多重FRET成像研究提供了可靠工具。

　　

在生命科学研究领域，科学家们一直致力于开发能够实时监测细胞内分子活动的工具。基因编码的荧光生物传感器作为这一领域的明星技术，特别是基于荧光共振能量转移（FRET）原理构建的传感器，已经成为研究细胞信号转导网络的重要武器。FRET技术通过能量从供体荧光蛋白向受体荧光蛋白的非辐射转移，能够灵敏地检测分子构象变化，从而反映各种生化活动的动态过程。

然而，尽管FRET生物传感器具有巨大潜力，其在实践应用中却面临着两大技术瓶颈。首先，常用的FRET比率（受体与供体信号比）作为FRET效率的替代指标，极易受到成像参数（如激光强度、探测器灵敏度设置）的影响，导致不同成像实验间的数据难以直接比较。其次，由于光谱空间的限制，同时成像多个FRET生物传感器几乎不可能，因为大多数FRET传感器都使用青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）及其变体作为FRET对，它们的发射光谱严重重叠。

这些限制使得大多数FRET生物传感器实验只能局限于单个成像会话，持续时间通常不超过几小时，严重制约了研究人员对复杂信号网络进行长期、多重监测的能力。正是为了解决这些棘手问题，约翰斯·霍普金斯大学的研究团队在《iScience》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员创新性地将最近开发的生物传感器条形码方法与校准标准相结合，提出了一种全新的解决方案。他们通过理论建模发现，FRET比率对激发强度的依赖性在高效FRET状态下尤为明显，这意味着有效的校准需要同时包含低FRET和高FRET两种状态的标准品。基于这一理论预测，团队成功构建了两种校准标准：FRET-ON（将CFP-YFP对锁定在FRET激活构象）和FRET-OFF（FRET失活构象）。

研究采用的主要技术方法包括：理论动力学建模分析FRET信号特性；构建FRET-ON和FRET-OFF校准标准；应用生物传感器条形码技术实现多重成像；四通道光谱成像测定实际FRET效率；时间序列成像结合双步校准法校正光漂白效应。所有实验均在HeLa细胞系中进行，通过瞬时转染或慢病毒转导表达各种FRET构建体。

理论建模支持双标准校准策略

研究团队首先建立了FRET的动力学理论模型，通过数值模拟分析了不同激发强度下FRET比率的变化规律。理论预测显示，在高FRET效率状态下，FRET比率会随着激发强度的增加而明显下降，而仅使用单一校准标准无法完全消除这种依赖性。

通过线性近似分析，研究人员推导出了校准后的FRET比率公式，理论上证明同时使用高、低两种FRET标准的校准方法可以有效地消除激发强度和其他成像参数的影响，为实验设计提供了坚实的理论基础。

成功构建稳定的FRET校准标准

基于理论指导，研究团队开发了两种实用的FRET校准标准。FRET-ON标准是通过对CytoFAK生物传感器进行Y349F突变而构建，该突变阻止了FAK（focal adhesion kinase）对底物的磷酸化，从而将CFP-YFP对锁定在高FRET状态。相反，FRET-OFF标准则是通过改造H3K9me3生物传感器，移除其组蛋白H3结构域并引入W45A突变而获得，确保其维持在低FRET状态。

实验验证表明，这两种校准标准在受到各种扰动（如EGF刺激、FAK抑制或去甲基化酶抑制）时，都能保持稳定的FRET比率，为后续的校准实验提供了可靠的工具。

条形码技术实现多重化成像

为了实现不同FRET构建体的同时成像，研究采用了生物传感器条形码策略。该技术利用蓝色或红色荧光蛋白（BFPs/RFPs）靶向不同亚细胞位置形成独特的条形码图案，这些条形码在光谱上与常用的CFP-YFP FRET对可区分。

通过将表达不同FRET构建体（校准标准或生物传感器）和特定条形码的细胞混合后同时成像，研究人员可以基于条形码识别每个细胞中表达的特定FRET构建体，从而实现多重化成像。

实验验证校准效果

在不同成像设置（激光功率和探测器增益的组合）下，研究人员同时成像了FRET-OFF、FRET-ON以及两种FRET生物传感器（CytoFAK和EKAR）。结果显示，未经校准的YFP/CFP比率在不同成像条件下存在显著差异，而经过FRET-ON和FRET-OFF标准校准后，CytoFAK的校准FRET效率在所有成像设置下保持一致，EKAR也只有微小且不显著的变异。

这一实验验证了双标准校准方法的有效性，表明校准后的FRET比率确实不受成像条件变化的影响。

简便测定实际FRET效率

传统测定实际FRET效率的方法需要多次成像步骤，过程繁琐且易受成像参数波动影响。本研究通过同时成像仅表达CFP、仅表达YFP以及校准标准的条形码细胞，建立了一种简化的FRET效率测定方法。

通过四通道成像（458nm激发/氰化物发射、458nm激发/黄色发射、514nm激发/氰化物发射、514nm激发/黄色发射）和相应的数学公式，研究人员成功计算出了FRET-OFF、FRET-ON和CytoFAK的实际FRET效率，分别为15.0%±1.6%、61.3%±3.5%和38.5%±2.9%。这种方法为快速、准确地测定多种FRET生物传感器的实际FRET效率提供了可行方案。

时间序列成像中的信号校准

在长时间成像过程中，荧光信号会因激发强度波动和光漂白效应而发生变化。研究人员通过监测未刺激条件下EKAR1生物传感器的活性，发现原始的YFP和CFP信号经常同向变化，这与FRET变化应有的供体-受体信号互逆变化模式不符。

通过双步校准法——首先将荧光信号归一化到FRET-OFF以校正成像参数波动和基础光漂白，然后根据FRET水平调整光漂白引起的互逆趋势——研究人员成功恢复了YFP和CFP信号之间的互逆关系。这种校准为观察到的FRET比率变化确实源于FRET效率变化而非成像伪影提供了关键验证。

研究结论与意义

本研究开发了一种基于多重生物传感器条形码的FRET信号稳健校准与定量方法，成功解决了FRET成像技术中长期存在的校准困难和多重化挑战。通过理论建模指导下的实验设计，研究人员证实了同时使用高、低FRET状态校准标准的必要性，并构建了相应的FRET-ON和FRET-OFF校准标准。

该方法的主要优势在于：首先，校准后的FRET比率不受成像设置变化的影响，使不同实验条件下的数据可以直接比较；其次，结合条形码技术，实现了多种FRET生物传感器的同时成像和校准；第三，提供了一种简便的实际FRET效率测定方法；最后，通过校正时间序列成像中的信号波动和光漂白效应，确保了长期成像实验的可靠性。

这项技术的意义远超出了方法学本身，它为研究复杂细胞信号网络提供了强大工具。通过实现多重、校准的FRET成像，研究人员现在能够同时监测多个信号通路的动态变化，揭示它们之间的相互作用和协调机制。特别是在研究疾病机制、药物反应以及遗传或环境扰动对活细胞系统的影响方面，这种方法具有广阔的应用前景。

尽管本研究主要针对CFP-YFP FRET对进行验证，但其所提出的校准策略和条形码方法原则上可以扩展到其他FRET对和比率型生物传感器，为荧光生物传感器领域的进一步发展奠定了重要基础。随着技术的不断完善和推广应用，这种校准方法有望成为FRET生物传感器研究的标准流程，推动细胞信号转导研究的精确化和定量化发展。