葡萄膜黑色素瘤肿瘤内在与外在通路靶点的综合分子分析揭示癌症干细胞与免疫微环境相互作用新机制

《iScience》：Comprehensive molecular analysis of uveal melanoma identifies targets in tumor-intrinsic and tumor-extrinsic pathways

本研究针对葡萄膜黑色素瘤(UM)治疗面临的癌症干细胞(CSCs)和肿瘤微环境(TME)两大关键挑战，通过多组学分析揭示了BAP1阴性肿瘤的免疫抑制特征。研究人员发现STAT3/ANGPTL4轴与干细胞特性相关，并鉴定出TNFRSF14、IKBKE等新型生物标志物。该研究为开发同时靶向肿瘤内在干细胞通路和外在免疫微环境的联合治疗策略提供了重要理论基础。

　　

葡萄膜黑色素瘤作为成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，虽然局部控制率较高，但近半数患者最终会发生致命性转移，尤其以肝转移为主，导致5年生存率骤降至15%左右。这一严峻现状背后的核心难题在于肿瘤的治疗抵抗性和转移潜能，而癌症干细胞(CSCs)和肿瘤微环境(TME)的相互作用被认为是关键驱动因素。

在分子层面，葡萄膜黑色素瘤具有特征性基因突变谱，约80%-90%病例存在GNAQ或GNA11突变，而BAP1基因失活见于50%的肿瘤，与不良预后密切相关。根据BAP1状态，基因表达谱(GEP)将肿瘤分为低风险类1型(BAP1野生型)和高风险类2型(BAP1突变型)。尽管已有分子分型系统，针对高风险和转移性葡萄膜黑色素瘤的有效治疗手段仍然有限，迫切需要揭示其耐药和转移机制的新见解。

在此背景下，Cernichiaro-Espinosa等研究人员在《iScience》上发表了最新研究成果，他们从胶质母细胞瘤(GBM)的研究中获得启示，发现STAT3和ANGPTL4在治疗抵抗性肿瘤中过度表达，且STAT3能促进GBM癌症干细胞样生态中ANGPTL4的表达。基于这一发现，研究团队系统性地探索了这两个分子在葡萄膜黑色素瘤中的表达模式、功能及其与癌症干细胞特性的关联。

研究技术方法主要包括：利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库进行生物信息学分析；使用葡萄膜黑色素瘤细胞系(OMM2.5、MEL270、MP41)进行基因表达和功能研究；采用shRNA基因敲低技术研究ANGPTL4的功能作用；对患者来源的原发性葡萄膜黑色素瘤和肝转移组织进行pan-cancer免疫 profiling微阵列分析；通过RNA原位杂交(RNA-ISH)和免疫组织化学(IHC)在组织水平验证基因表达；利用DepMap数据库进行CRISPR-Cas9基因依赖性分析。样本队列包括10例摘除眼标本(5例原发性、5例经斑块放射治疗后摘除)和14例肝标本(4例转移性葡萄膜黑色素瘤、5例非肿瘤肝组织、4例肝细胞癌、1例肝转移性神经内分泌肿瘤)。

STAT3和ANGPTL4在葡萄膜黑色素瘤细胞系中的基因表达

研究人员首先分析TCGA数据，发现STAT3和ANGPTL4表达呈显著正相关(r=0.34, p=0.0020)，且高表达与患者不良生存率相关。在三种葡萄膜黑色素瘤细胞系中，均检测到干细胞标志物(CD44、CD133、Nestin、OCT4、Sox2)以及STAT3和ANGPTL4的表达。通过shRNA敲低ANGPTL4后，MEL270细胞中STAT3表达显著降低，OMM2.5细胞中也观察到下降趋势，提示两者存在表达相关性。

Pan-cancer免疫 profiling微阵列及原发性葡萄膜黑色素瘤和肝转移的细胞通路和基因表达综合多维分析

研究人员通过pan-cancer免疫基因微阵列比较原发性和治疗后转移性葡萄膜黑色素瘤肿瘤，鉴定出67个差异表达基因(DEGs)，包括TNFRSF14、IKBKE、IRF3、MAPK11和PLA2G6等。与其它肝肿瘤和正常肝组织相比，转移性葡萄膜黑色素瘤肝肿瘤有38个基因差异表达，其中TNFRSF14和PLA2G6在原发性眼肿瘤和肝转移灶中均高表达。

全局显著性评分(GSC)通路分析显示，转移性葡萄膜黑色素瘤肿瘤中补体和细胞周期通路受影响最显著。比较BAP1阳性和阴性原发性肿瘤发现，BAP1阴性样本中TNF超家族成员和T细胞标志相关信号均下调，提示免疫抑制状态。

候选基因表达的TCGA数据分折及其与BAP1表达和葡萄膜黑色素瘤临床结局的相关性

热图分析显示TNFRSF14、IKBKE、IRF3等免疫相关基因以及NESTIN等干细胞相关基因与BAP1表达呈负相关。重要的是，TNFRSF14、IKBKE和IRF3高表达与患者总生存期(OS)缩短显著相关，其中IKBKE高表达使OS降低九倍。

IKBKE、IRF4、ANGPTL4和STAT3在葡萄膜黑色素瘤原发性肿瘤和肝转移中的表达增强

RNA-ISH分析证实，与正常脉络膜组织和非葡萄膜黑色素瘤肝活检组织相比，这些候选基因在葡萄膜黑色素瘤肿瘤中表达升高。微阵列数据与RNA-ISH结果高度一致，验证了这些基因的异常表达。

组织病理学和细胞类型分析揭示免疫学"冷"肿瘤微环境

CD45免疫组织化学染色显示原发性葡萄膜黑色素瘤肿瘤中仅有少量CD45阳性细胞。ROSALIND细胞类型分析进一步证实，肿瘤微环境中巨噬细胞最丰富，辅助性T细胞1和细胞毒性T细胞评分较低，表明免疫细胞浸润有限。

免疫学"冷"原发性葡萄膜黑色素瘤肿瘤和转移性葡萄膜黑色素瘤肝脏肿瘤细胞中观察到高TNFRSF14表达

尽管肿瘤组织炎症反应轻微，但免疫组织化学显示TNFRSF14在原发性葡萄膜黑色素瘤肿瘤和肝转移灶中高免疫反应性，而在非肿瘤对照肝组织中无此现象。RNA-ISH进一步证实TNFRSF14由葡萄膜黑色素瘤细胞表达，表明它是免疫学"冷"肿瘤中表达的肿瘤细胞生物标志物。

微阵列数据的相互作用图分析

相互作用图分析显示，IRF4、STAT3、IKBKE和TNFRSF14与干细胞标志物CD44存在密切相互作用网络，而与免疫细胞浸润标志物CD45的相互作用较少，提示候选基因与干细胞相关通路的相互作用比与肿瘤微环境相关通路更为广泛。

DepMap CRISPR-Cas9计算机模拟功能分析

利用DepMap数据库的基因效应评分(GES)分析显示，IRF4和STAT3具有最强的负GES，表明葡萄膜黑色素瘤细胞，特别是转移性细胞，高度依赖这些基因生存。而ANGPTL4、IKBKE和TNFRSF14主要呈现正GES，表明它们的敲除不影响细胞活力。IRF3在转移性和非转移性细胞系中表现出不同的GES模式，提示其作用可能具有情境依赖性。

研究结论与讨论部分强调，这项研究通过综合分子分析揭示了葡萄膜黑色素瘤中肿瘤内在干细胞特性与外在免疫微环境信号之间的复杂相互作用网络。STAT3和ANGPTL4作为与癌症干细胞特性相关的关键分子，其表达相关性在TCGA数据和细胞系实验中均得到验证。尤其重要的是，研究发现即使在免疫学"冷"的肿瘤中，TNFRSF14仍在肿瘤细胞中高表达，且与不良预后相关，提示它可能作为连接免疫信号和干细胞特性的关键分子。

BAP1阴性肿瘤表现出独特的免疫抑制特征，包括TNF超家族基因和T细胞功能相关基因的下调，这为理解高风险葡萄膜黑色素瘤的免疫逃逸机制提供了新视角。相互作用网络分析进一步支持了候选基因与干细胞通路而非免疫浸润通路的密切联系，突出了靶向癌症干细胞的重要性。

从治疗策略角度看，这些发现表明同时针对肿瘤内在通路(如STAT3/ANGPTL4轴)和外在免疫调节因子(如TNFRSF14)可能更有效。尤其值得关注的是，TNFRSF14作为免疫调节分子，在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达模式暗示它可能通过与其配体LIGHT的相互作用调节T细胞功能，从而影响免疫监视效果。

研究的局限性包括需要更大样本队列的验证，以及临床前模型与人类肿瘤生物学差异带来的挑战。然而，这项综合分析方法为识别治疗靶点和推动葡萄膜黑色素瘤药物开发提供了有前景的路径。未来研究应着重探索这些候选基因在癌症干细胞维持、肿瘤增殖和凋亡抑制中的具体机制，以及它们作为联合治疗靶点的转化潜力。