基于次指数模型推断揭示病毒进入的复杂动力学机制

《Biophysical Journal》：Unmasking complex kinetics in viral entry by inferring hypoexponential models

本刊推荐：研究人员针对单事件动力学数据难以解析复杂反应拓扑的问题，开展了利用次指数模型推断病毒进入复杂动力学的研究。结果表明，次指数分析能够有效估计差异达2-3个数量级的速率常数，并应用于SARS-CoV-2病毒进入研究，发现ACE2受体减少了限速步骤数量但不改变其速率，提出了ACE2加速与非依赖性刺突蛋白激活事件共同驱动病毒进入的新机制，为理解病毒入侵提供了重要新见解。

　　

在分子生物物理学领域，病毒如何进入宿主细胞是一个充满挑战的科学问题。这一过程本质上涉及病毒颗粒与细胞膜之间一系列复杂的随机相互作用，最终导致病毒遗传物质释放到细胞质中。传统的研究方法通常测量大量病毒颗粒的平均行为，但这种“群体平均”数据往往会掩盖单个病毒颗粒行为的关键细节，就像听一场交响乐的总和声而无法分辨每件乐器的独奏部分。单病毒技术(single-virus techniques)的出现，使得科学家能够像使用高灵敏度麦克风聆听每件乐器一样，实时观测单个病毒颗粒的入侵过程，记录下从触发融合到完成融合的精确“等待时间”。

然而，从这些宝贵的单事件数据中提取准确的动力学机制信息并非易事。当实验只能观测到反应的起始和结束状态，而对中间过程“视而不见”时，就如同只知道一场旅行的起点和终点，却不清楚中间经过了多少个车站、每个车站停留了多久。现有的分析方法，如伽马分布(gamma distribution)拟合，通常假设多步反应中每一步的速率都相同，这显然与现实世界中生物分子反应的复杂性不符——不同的反应步骤完全可能以截然不同的速率进行。

针对这一技术瓶颈，弗吉尼亚大学的Oyinkansola Adenekan和Peter M. Kasson研究团队在《Biophysical Journal》上发表了他们的最新研究成果。他们开发并验证了一种基于次指数分布(hypoexponential distribution)的分析方法，能够更精准地从单病毒融合实验中解析出包含不同速率常数的复杂动力学模型。这项技术不仅能够区分反应中包含的步骤数量，还能准确估计每个步骤特有的速率常数，即使这些速率相差高达100-1000倍。

研究人员主要运用了几项关键技术方法：首先，他们通过单病毒荧光显微镜技术(single-virus fluorescence microscopy)实时监测病毒与模型膜之间的脂质混合过程，记录单个病毒的融合等待时间；其次，他们利用吉莱斯皮算法(Gillespie algorithm)生成已知参数的合成数据，用于验证分析方法的可靠性；最后，他们采用马尔可夫链蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)采样方法，特别是Metropolis-Hastings算法，来拟合次指数分布模型并估计后验概率分布。所使用的SARS-CoV-2病毒样颗粒融合数据来自已发表研究，而流感病毒数据则由合作者提供。

次指数采样在重建合成数据生成模型方面优于伽马分析

研究团队首先通过计算机模拟生成了已知“真实参数”的合成数据，这些数据模拟了包含2个或3个动力学步骤的反应过程，且各步骤的速率常数(k_i)从完全相同到相差10万倍不等。通过系统比较次指数分布拟合与传统的伽马分布拟合，他们发现当速率常数相似或差异极大时，两种方法都能较好地重现累积分布函数(CDF)。然而，当速率存在中等程度差异时，次指数分析在恢复真实动力学参数方面表现出明显优势。特别是对于快速步骤的速率估计，伽马分布由于假设所有步骤速率相同，其误差始终超过50%，而次指数分析则能更准确地捕捉到快速步骤的动力学信息。

两步反应中的性能表现

对于两步反应系统，次指数采样在恢复速率常数(k₁, k₂)和步骤数量(N)方面均优于伽马分析。具体而言，次指数方法能恢复约90%的慢速速率(误差<20%)，而伽马方法约为70%。对于快速速率，次指数方法的优势更加明显，其误差在速率相差100倍以上时才超过50%，而伽马方法在速率非相同时误差始终高于50%。在步骤数量恢复方面，次指数采样在速率相差1000倍以内时都能准确恢复N值，而伽马拟合仅在速率相差100倍以内时有效。

三步反应中的性能表现

研究团队还将分析方法扩展到更复杂的三步反应系统。结果显示，对于最慢步骤的速率恢复，次指数采样(89%的案例误差≤20%)略优于伽马分析(63%)。对于中间速率和最快速率，次指数方法的优势更加显著，特别是在最快速率的恢复上，伽马方法在速率非相同时完全失效，而次指数方法仍能恢复30%案例的速率(误差≤50%)。这进一步证实了次指数分析在处理具有异质速率的多步反应方面的能力。

随机性参数为步骤数量估计提供稳健指标

研究人员还评估了随机性参数(randomness parameter, r)的效用，该参数定义为r=(<>²>-²)/²，其中t代表单事件等待时间。由此计算的最小步骤数N_min=1/r，为线性反应方案所需的最少步骤数提供了一个与模型无关的估计。研究发现，对于两步反应系统，基于ceil(N_min)（即N_min的上取整）的估计器在确定步骤数量方面优于基于AICc（校正的Akaike信息准则）的模型选择或伽马拟合的N参数，尤其是在速率差异较大的情况下。这表明随机性参数是一个强大的工具，可用于初步评估反应复杂性。

估算流感病毒进入的多步动力学

将次指数分析应用于流感病毒膜融合数据后，研究团队发现脂质混合过程最符合两步动力学模型，这与伽马拟合和随机性参数分析的结果一致。通过检查后验概率分布，他们进一步确认了动力学参数的可靠性。值得注意的是，当拟合的步骤数超过随机性参数建议的最小步骤数时，模型会显示出N个难以区分的速率常数（近似相等），而额外的步骤则对应着远快于主要限速步骤的速率常数。这表明次指数采样的失败模式倾向于“过度报告”不同的速率常数，而不是错误地将不同的速率报告为相同，这在一定程度上降低了错误解读的风险。

次指数分析提示ACE2在SARS-CoV-2融合中作用的“不对称”模型

最引人入胜的发现来自于对SARS-CoV-2病毒样颗粒(VLP)融合数据的分析。先前的研究表明，ACE2受体并非SARS-CoV-2膜融合的生化必需条件，但会改变融合的动力学特征。传统的伽马分析显示，在没有ACE2时，融合过程涉及约2个限速步骤；而在有ACE2时，则减少为约1个限速步骤。次指数分析不仅证实了这一基本发现，还提供了更深入的机制见解。

次指数拟合结果显示，在无ACE2条件下，两个速率常数k₁和k₂非常接近（约为0.0031 s^-1和0.0033 s^-1）；而在有ACE2条件下，拟合得到一个速率常数约为0.00338 s^-1。关键在于，这些速率值高度相似，且与伽马拟合（假设速率相同）得到的速率常数（约0.0030 s^-1）也基本一致。这一发现表明，ACE2的存在并未改变限速步骤本身的速率，而是减少了限速步骤的数量。

基于此，研究人员提出了一个创新的“可变化学计量模型”(variable-stoichiometry model)来解释SARS-CoV-2的融合动力学。该模型认为，病毒的融合需要多个刺突蛋白(spike protein)的协同激活。每个刺突蛋白的激活事件都以速率k_s发生，并将融合激活能垒降低ΔG_s。在无ACE2情况下，两个刺突蛋白的激活事件以相近的速率发生，均为k_s（即ACE2非依赖性激活），因此表现为两个速率相近的步骤。而当存在ACE2时，其中一个刺突蛋白的激活被ACE2显著加速，以至于其速率快得不再是限速步骤，从而在实验观测的时间尺度上“消失”；而第二个刺突蛋白的激活仍以原始的k_s速率进行（ACE2非依赖性），因此观测到的融合动力学表现为单一限速步骤，其速率与无ACE2时的速率基本相同。

这种看似“不对称”的 scenario 可能源于ACE2-刺突蛋白相互作用的两个特性：一是病毒接触区域ACE2分子数量通常较低，使得第二个刺突蛋白与ACE2的相遇速率可能低于其自发激活速率；二是ACE2已被观察到会驱动未立即进行融合的刺突蛋白三聚体自发失活，这限制了第二个刺突蛋白被招募的时间窗口。实验上，添加高浓度可溶性ACE2可使融合动力学恢复至与无ACE2时相似，这更支持了ACE2结合后刺突蛋白失活是控制因素模型。

该研究开发并验证的次指数分析方法，为从单事件完成时间数据中提取复杂动力学信息提供了强大工具。其意义在于明确区分了生物分子过程中限速步骤是单一、多个且相同、还是多个且异质这三种情况，这是传统伽马分析难以做到的。对于SARS-CoV-2病毒进入机制，研究不仅证实了ACE2减少限速步骤数量的现象，更重要的是通过证明剩余限速步骤速率不变，提出了一个关于ACE2作用模式的全新、可检验的机制假说——即ACE2以不对称方式加速刺突蛋白激活，而非均匀地改变所有激活事件。这一发现深化了对冠状病毒入侵机制的理解，并展示了先进数据分析方法在揭示生物物理学深层机制中的关键作用。未来通过调节病毒-ACE2相遇速率的实验，将进一步检验这一模型并比较其与生理条件下病毒-细胞相遇的关联。