基于Prime Editing技术探究PRPH2 c.828+1G>A剪接突变致视网膜疾病的机制与基因治疗新策略

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Prime editing for the investigation of aberrant splicing defect associated with a pathogenic PRPH2 variant

本研究针对PRPH2基因c.828+1G>A剪接位点突变引发的遗传性视网膜疾病（IRD），开发了基于Prime Editing（PE）技术的基因编辑平台。研究人员成功在人诱导多能干细胞（hiPSC）中构建并纠正该突变，证实突变导致隐性剪接位点激活及内含子滞留，并在视网膜类器官模型中重现病理转录本异常。该工作首次将PE技术应用于PRPH2相关疾病建模，为基因治疗提供了精准安全的策略，推动了基因型-表型关联研究及治疗开发。

　　

在遗传性视网膜疾病（Inherited Retinal Diseases, IRD）的研究领域中，PRPH2（Peripherin-2）基因突变导致的病变因其表型多样性和基因剂量敏感性而备受关注。PRPH2编码的蛋白质是光感受器外段盘膜结构的关键组分，其突变可引起常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP）、黄斑营养不良等多种致盲性疾病。尽管目前已报道367种PRPH2变异，但基因型与临床表型的关联仍不明确，且缺乏有效治疗手段。尤其对于罕见剪接位点突变（如c.828+1G>A），患者来源的生物样本难以获取，限制了疾病机制研究和治疗开发。

为克服这一瓶颈，Liu Siyuan等研究人员在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表论文，利用新兴的Prime Editing（PE）技术，在健康hiPSC中精准引入PRPH2 c.828+1G>A突变，构建等基因疾病模型，并评估其纠正突变的能力。PE作为一种不引起DNA双链断裂（DSB）的基因编辑工具，可通过逆转录酶与Cas9切口酶协同实现精准的碱基替换，适用于单核苷酸变异疾病的建模与治疗探索。

本研究的关键技术方法包括：1）设计并优化包含GFP报告基因的全合一PE载体系统，通过脂质体转染导入hiPSC；2）利用流式细胞分选富集编辑细胞，并通过二代测序（NGS）和双脱氧测序验证编辑效率与特异性；3）通过核型分析和多能性标志物检测评估编辑后细胞基因组稳定性与分化潜能；4）在hiPSC及分化的DD50/DD100阶段视网膜类器官中，通过实时定量PCR（qPCR）及免疫荧光染色分析PRPH2转录本表达与剪接异常；5）利用环己酰亚胺（CHX）抑制无义介导的mRNA降解（NMD），验证突变转录本的稳定性。

All-in-one prime editing system efficiently generates edited hiPSCs clones

研究人员构建了包含PE2/PE3系统元件的全合一载体，通过优化转染条件在hiPSC中实现高效编辑。结果显示，GFP阳性细胞中编辑效率达24%，且高低GFP表达群体间无显著差异。成功获得PRPH2 c.828+1G>A杂合与纯合敲入克隆，编辑过程未引起明显的indel（插入/缺失）突变。

Prime editing does not result in off-targeting effects, and it does not affect hiPSCs pluripotency

通过Cas-OFFinder预测pegRNA和nsgRNA的潜在脱靶位点，并经双脱氧测序验证，PE编辑后的克隆在12个pegRNA相关和9个nsgRNA相关脱靶位点均未出现非特异性突变。核型分析表明编辑未引起染色体畸变，且细胞保持OCT3/4、NANOG等多能性标志物表达，具备向三胚层分化的能力。

The PRPH2 c.828+1G>A mutation causes aberrant splicing in hiPSCs

NetGene2软件预测显示c.828+1G>A突变导致PRPH2外显子2经典剪接位点完全丧失。cDNA PCR及测序证实突变激活下游隐性剪接位点，引起内含子2中29 bp的滞留，形成突变转录本。qPCR分析显示，纯合克隆中突变转录本占比达99.5%，而杂合克隆中为4.7%。CHX抑制实验表明突变转录本仅部分通过NMD降解，提示其可能产生截短蛋白。

Toward PRPH2 c.828+1G>A disease modeling and therapy

野生型与杂合突变hiPSC衍生的视网膜类器官在DD50和DD100阶段均呈现正常形态及OTX2阳性光感受器前体细胞。随分化进行，野生型类器官中PRPH2转录本表达显著上升，而杂合突变类器官在DD100时出现经典转录本降低和突变转录本升高。通过PE系统筛选（pegRNA2与nsgRNA3组合），在纯合突变hiPSC中实现5.9%的基因组纠正效率，并伴随突变转录本7.86%的降低及经典转录本的相应恢复。

本研究首次利用PE技术成功构建PRPH2剪接突变疾病模型，揭示c.828+1G>A通过隐性剪接位点激活导致内含子滞留的分子机制。其在视网膜类器官中重现疾病相关转录本异常，为表型研究提供了可靠平台。此外，PE介导的突变纠正实验证实其在基因组和转录水平均可部分恢复正常剪接，为PRPH2相关IRDs的基因治疗提供了新思路。该策略克服了患者样本稀缺的限制，推动了精准医疗背景下等基因模型的应用，并为其他剪接位点突变疾病的机制研究与治疗开发树立了范式。