分枝杆菌研究中的替代模型：克服生物安全限制的系统综述

《Journal of Applied Microbiology》：Surrogate models in pathogenic Mycobacterium research: A systematic review

本刊推荐：为解决结核分枝杆菌等病原菌研究受BSL-3实验室限制的难题，研究人员系统综述了分枝杆菌替代模型的应用现状。研究发现耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)因其快速生长和遗传可操作性成为最常用替代模型，海分枝杆菌(M. marinum)在毒力研究方面表现突出。该研究为在低生物安全等级条件下开展抗结核药物、疫苗研发提供了重要指导。

　　

在微生物研究领域，有一个令人头疼的难题：如何安全地研究那些致命病原体？结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)作为结核病的元凶，其研究必须在生物安全三级(BSL-3)实验室中进行。这种高等级的生物安全要求不仅增加了研究成本，还大大限制了科研人员的研究机会。面对这一困境，科学家们开始寻找一种巧妙的解决方案——使用安全的替代模型。

这些替代模型就像是病原体的"替身演员"，它们能够模拟病原菌的关键特性，却不会带来安全风险。那么，这些替代模型究竟能否胜任这一角色？它们在哪些研究领域表现最佳？又存在哪些局限性？来自意大利佛罗伦萨大学的研究团队通过系统综述的方法，对过去二十多年相关研究进行了全面梳理，研究成果发表在《Journal of Applied Microbiology》上。

研究人员采用了系统综述的方法，对PubMed、Web of Science、Scopus和Google Scholar等数据库进行了全面检索，筛选出200篇相关文献。通过标题摘要筛选和全文评估的两步法，最终纳入符合标准的76项研究。研究团队建立了标准化的数据提取清单，重点关注发表年份、研究目的、使用的替代微生物、目标病原体以及研究类别等信息。

研究结果呈现出丰富的研究图景。从时间趋势来看，替代模型的研究在2015年达到高峰，这与世界卫生组织"终结结核病策略"的实施时间相吻合，显示出政策导向对科研热点的推动作用。

在研究主题分布上，科学家们将相关研究分为六大类别：分枝杆菌生理学、化学控制、生物控制、检测方法验证、感染模型验证和环境研究。结果显示，分枝杆菌生理学研究最为活跃，有超过40项研究，主要集中在比较基因组学、毒力与免疫逃逸、应激反应等方面。化学控制研究位列第二，涉及药物发现和消毒方法评估。而环境研究则相对薄弱，这可能是由于该领域传统上获得的资助较少。

在替代模型的选择上，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)脱颖而出，成为最常用的替代模型。这主要得益于其相对于病原性分枝杆菌更快的生长速度、遗传可操作性和非致病性特点。海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)作为BSL-2级生物，在毒力研究、应激反应和疾病建模方面发挥了重要作用。而牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis BCG)则主要应用于疫苗研究，同时也出现在药物测试中。

分枝杆菌生理学研究

在比较基因组学方面，研究发现耻垢分枝杆菌mc2155与结核分枝杆菌共享数千个保守的基因直系同源物，并具有相似的细胞结构和生理特性。基因组比较显示，结核分枝杆菌H37Ra中有2,816个蛋白质编码基因与耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG共享，这表明替代模型在基因组水平上具有一定的代表性。

毒力与免疫逃逸机制的研究是另一个重点领域。ESX家族蛋白和PE/PPE蛋白家族是分枝杆菌属特有的毒力因子。研究人员利用耻垢分枝杆菌作为异源表达宿主，成功表达了结核分枝杆菌的PE/PPE蛋白，发现这些蛋白能够影响细菌在巨噬细胞中的存活能力。特别值得关注的是ESX-1型VII分泌系统，它是病原性分枝杆菌的关键毒力因子，编码在RD1区域。

海分枝杆菌在这一研究领域展现出独特价值。研究表明，海分枝杆菌和结核分枝杆菌的ESX-1系统在功能上是等价的，而且海分枝杆菌能够引起类似结核的感染并形成肉芽肿，这为研究结核病的发病机制提供了宝贵模型。研究人员还发现，分枝杆菌脂质phthiocerol dimycocerosates(PDIMs)与ESX-1协同作用，促进病原菌的毒力表现。

除了毒力因子，研究人员还利用替代模型研究了一系列重要的生理过程。Clp蛋白酶复合物作为重要的蛋白水解机器，参与病原菌生理和毒力调节，是药物开发的潜在靶点。结核分枝杆菌必需的麦芽糖基转移酶GlgE的研究则利用了耐热分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)作为模型，通过高分辨率X射线晶体学揭示了其催化结构域的相互作用。

堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)被证明是研究结核分枝杆菌进化过程的合适模型。通过将结核分枝杆菌特有的rv3377c-rv3378c基因对引入堪萨斯分枝杆菌，研究人员成功模拟了从环境微生物向人类病原体的进化转变过程。

在应激反应研究方面，耻垢分枝杆菌再次证明了其价值。研究发现，在不同应激条件下，耻垢分枝杆菌的代谢通路会发生特异性改变：甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢在酸性和氧化应激下显著受影响，而烟酸-烟酰胺通路主要在氧化应激下被破坏。这些发现为了解分枝杆菌的应激适应机制提供了重要线索。

双组分调控系统是细菌感知和响应环境变化的重要机制。研究人员利用耻垢分枝杆菌研究了结核分枝杆菌的PrrAB系统，发现这一系统在细胞分裂、呼吸和微需氧条件适应中起关键作用。碳中心代谢的灵活性对分枝杆菌生理和致病性也至关重要，丙酮酸激酶作为糖酵解关键酶，在应激条件下通过AMP和葡萄糖-6-磷酸的调节维持糖酵解活性。

化学控制研究

在药物发现领域，替代模型的应用尤为广泛。结核分枝杆菌形成生物膜样结构的能力是其持久存在的重要原因，这些生物膜能够保护细菌免受宿主免疫系统和抗生素的攻击。研究人员通过多种替代生物初步筛选化合物，再进行针对病原菌的测试，大大提高了药物发现的效率。

植物提取物的抗菌活性研究是一个典型例子。科学家们首先测试了45种新西兰本土植物提取物对耻垢分枝杆菌的抗菌活性，然后选择有活性的提取物进一步测试其对牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌的作用。这种方法成功鉴定出具有抗结核活性的植物成分。

纳米颗粒和低频低强度超声(LFLIU)的结合使用代表了另一种创新策略。研究表明，超声能够增强耻垢分枝杆菌细胞壁的通透性，从而提高抗生素的杀菌活性。当与载药纳米颗粒结合时，这种联合策略能够促进抗生素释放并刺激细胞内活性氧的产生，最终导致细胞内细菌死亡。

替代模型在药物靶点验证方面也发挥了重要作用。通过高通量筛选，研究人员使用牛分枝杆菌BCG作为替代模型，发现了针对分枝杆菌细胞 envelope生物合成的新抑制剂。其中，乙酰胺化合物E11显示出强烈的杀菌活性，其作用机制可能是通过破坏质子动力靶向霉菌酸转运蛋白MmpL3。

然而，研究也揭示了替代模型的局限性。比较研究表明，耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌对化合物库的抑制反应存在显著差异。耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌之间的相关性较弱，而牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌的抑制谱更为接近。这一发现对药物筛选策略具有重要启示。

为提高替代模型的预测价值，研究人员开发了耻垢分枝杆菌Δarr菌株，该菌株对利福平的敏感性显著提高，与结核分枝杆菌更为接近，为筛选利福平类似物提供了更准确的平台。

其他研究领域

在消毒方法研究方面，分枝杆菌由于其脂质丰富的细胞壁而表现出显著的抵抗力。工程水纳米结构(EWNS)作为一种新型消毒策略，能够稳定活性氧并将其直接递送至细菌表面，诱导显著的脂质过氧化和膜破坏。

生物控制研究探索了细菌和噬菌体作为微生物控制剂的潜力。乳酸菌作为野生猪分离的共生菌，显示出对抗分枝杆菌的活性。噬菌体疗法则提供了针对有害细菌群体的靶向控制手段，在气溶胶和表面消毒应用中显示出潜力。

检测方法验证研究开发了基于腺苷酸激酶释放的高灵敏度报告检测法，能够识别所有诱导分枝杆菌细胞裂解的化合物。同时，新型光学纤维免疫传感器等诊断工具的开发也为结核病早期检测提供了新可能。

感染模型验证研究提出了多种替代宿主系统，包括斑马鱼、青鳉鱼、黑腹果蝇和蜡螟等。这些模型为研究宿主-病原体相互作用提供了低成本、易操作的平台。

环境研究是目前最为薄弱的领域。研究表明，耻垢分枝杆菌在灰尘中能够存活超过19天，并可重新气溶胶化，这为了解结核分枝杆菌在环境中的存活和传播提供了参考。

研究结论与展望

该系统综述全面评估了分枝杆菌研究中替代模型的应用现状和价值。研究表明，替代模型通过多种策略为结核病研究提供了重要工具：包括诱导免疫反应、异源蛋白表达和功能比较、毒力和免疫调节研究、转录谱分析、药物敏感性建模、杀菌剂反应筛选、作用机制研究以及酶功能表征等。

然而，不同替代模型各有其优势和局限性。耻垢分枝杆菌虽然应用广泛，但其在药物敏感性测试中的预测价值有限。海分枝杆菌由于与结核分枝杆菌具有更近的亲缘关系和致病相似性，在药物测试、毒力研究和宿主-病原体相互作用研究中展现出更大价值。

研究还指出，环境研究是当前最需要加强的领域。了解病原菌在环境中的存活、传播和适应机制，特别是对于牛分枝杆菌等影响畜牧业的病原体，对制定有效的疾病控制策略至关重要。

尽管对病原菌的直接研究仍是金标准，但替代模型作为初步筛选和指导研究方向的工具具有不可替代的价值。选择合适的替代模型，并使其与研究目标精确匹配，对推进稳健、可重复和具有转化价值的研究至关重要。随着技术的不断发展，替代模型必将在结核病研究中发挥越来越重要的作用，为最终战胜这一全球健康威胁贡献力量。