Pleckstrin-2（PLEK2）通过HOXD9/AKT信号轴调控乳腺癌细胞糖酵解、迁移和侵袭的机制研究

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Mechanistic Study of the Role of Pleckstrin-2 in Glycolysis, Migration and Invasion of Breast Cancer Cells

本研究旨在阐明Pleckstrin-2（PLEK2）在乳腺癌（BC）进展中的作用。研究人员发现PLEK2在BC组织中显著高表达且与不良预后相关。功能实验表明，PLEK2通过调控PI3K/AKT/mTOR通路和HIF-1α蛋白水平，影响糖酵解关键基因（如GLUT1、HK2、LDHA）的表达，从而促进BC细胞的迁移、侵袭和糖酵解活性。此外，研究首次证实转录因子HOXD9直接调控PLEK2的转录。靶向HOXD9/PLEK2/AKT信号轴可能为BC治疗提供新策略。

　　

乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一。其复杂性源于众多遗传、表观遗传和环境因素，这些因素共同促进了肿瘤的发生和发展。尽管治疗手段不断进步，但乳腺癌的转移和复发仍然是临床面临的巨大挑战，因此，深入理解其分子机制并识别新的治疗靶点变得至关重要。

在这一背景下，一个名为Pleckstrin-2（PLEK2）的蛋白引起了研究人员的注意。PLEK2是pleckstrin蛋白家族的成员，参与细胞骨架重组和信号转导等多种细胞过程。近年来的研究表明，PLEK2在肺癌、前列腺癌等多种癌症中过度表达，并与肿瘤生长和转移增加相关，暗示其可能是一个癌基因。然而，PLEK2在乳腺癌中的具体角色，特别是它如何影响乳腺癌细胞的恶性行为，仍然模糊不清。为了解决这一知识空白，来自北京中医药大学深圳医院（龙岗）科教部的肖萌、尹志杰、吴华、王丽静和石园园的研究团队开展了一项深入的机制研究，旨在阐明PLEK2在乳腺癌进展中的作用，特别是其与转录因子Homeobox D9（HOXD9）和AKT信号通路的关联。他们的研究成果发表在《Biochemical and Biophysical Research Communications》上。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们首先利用癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库进行生物信息学分析，比较了乳腺癌组织与正常组织中PLEK2的表达水平及其与患者预后的关系。在细胞水平，他们使用了人乳腺癌细胞系（如MDA-MB-231, MCF-7, SKBR3）和正常人乳腺上皮细胞MCF10A，通过定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）技术验证了PLEK2的表达。为了探究PLEK2的功能，研究人员采用了基因敲低（使用shRNA）和基因过表达（使用慢病毒载体）技术。细胞功能实验包括划痕实验（Wound healing assay）和Transwell小室实验（迁移和侵袭实验）来评估细胞的迁移和侵袭能力。在代谢方面，他们通过流式细胞术检测葡萄糖摄取（使用2-NBDG探针），并使用商业试剂盒测量细胞培养上清中的乳酸和ATP水平，以评估糖酵解活性。分子机制探索则涉及蛋白质印迹法分析PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白及其磷酸化水平，以及缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和糖酵解相关基因（GLUT1, HK2, LDHA）的蛋白表达。为了揭示PLEK2的上游调控机制，研究人员还进行了双荧光素酶报告基因实验（Dual Luciferase reporter assay）和染色质免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR），以验证转录因子HOXD9对PLEK2启动子的直接结合和调控作用。统计分析使用GraphPad Prism 8软件进行。

3.1. PLEK2在人类乳腺癌中高表达并与不良预后相关

研究人员通过分析TCGA和GEPIA数据库发现，与正常组织相比，PLEK2在乳腺癌组织中的mRNA表达水平显著升高。随后，他们在多种乳腺癌细胞系（T47D, MDA-MB-231, SKBR3）中通过qPCR和Western blot验证了这一结果，证实PLEK2在蛋白和mRNA水平均显著上调。更重要的是，TCGA数据库的分析显示，PLEK2的高表达与乳腺癌患者的不良预后密切相关。这些发现表明PLEK2可能作为乳腺癌的一个潜在生物标志物和不良预后的预测指标。

3.2. 敲低PLEK2可减少MDA-MB-231、MCF-7和SKBR3细胞的迁移和侵袭

为了探究PLEK2的功能，研究团队选择了具有侵袭性三阴性特征的MDA-MB-231细胞和雌激素受体阳性的MCF-7细胞，以及HER2阳性的SKBR3细胞进行功能丧失实验。他们构建了靶向PLEK2的shRNA慢病毒，并成功感染细胞，有效降低了PLEK2的表达。划痕实验结果显示，敲低PLEK2显著减缓了这三种乳腺癌细胞的伤口愈合速度。Transwell迁移和侵袭实验进一步证实，敲低PLEK2后，穿过小室膜的细胞数量明显减少。这些结果强有力地证明，PLEK2是促进乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的关键因子。

3.3. PLEK2沉默通过影响AKT/mTOR信号和糖酵解基因表达降低MDA-MB-231和MCF-7细胞的糖酵解活性

癌细胞的一个重要特征是其代谢重编程，即倾向于进行有氧糖酵解（瓦博格效应）。本研究深入探讨了PLEK2在乳腺癌细胞糖酵解中的作用。通过流式细胞术检测2-NBDG葡萄糖类似物的摄取，研究人员发现敲低PLEK2后，MDA-MB-231和MCF-7细胞的葡萄糖摄取量显著下降。同时，试剂盒检测结果显示，细胞上清液中的乳酸产量和细胞内的ATP水平也因PLEK2沉默而降低。基因集富集分析（GSEA）提示PLEK2可能通过AKT信号通路发挥作用。Western blot实验证实，敲低PLEK2抑制了AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平。此外，PLEK2沉默还降低了HIF-1α的蛋白水平，进而下调了其靶基因——糖酵解关键酶GLUT1、HK2和LDHA的mRNA和蛋白表达。这些发现表明，PLEK2可能通过激活AKT/mTOR信号通路，上调HIF-1α，进而促进糖酵解相关基因的表达，最终增强乳腺癌细胞的糖酵解代谢。

3.4. PLEK2过表达增强MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移、侵袭和糖酵解活性

为了进一步确认PLEK2的功能，研究人员进行了功能获得性实验。他们构建了PLEK2过表达慢病毒并感染MDA-MB-231和MCF-7细胞。与敲低实验的结果相反，过表达PLEK2显著促进了细胞的伤口愈合能力和Transwell迁移/侵袭能力。在代谢方面，过表达PLEK2的细胞表现出更高的葡萄糖摄取、乳酸产量和ATP水平。同时，Western blot分析显示，AKT和mTOR的磷酸化水平以及HIF-1α的蛋白表达均有所增加。这些结果从另一个角度证实了PLEK2在促进乳腺癌细胞恶性表型和糖酵解中的积极作用。

3.5. PLEK2过表达减轻LY294002对MCF-7细胞迁移、侵袭和糖酵解的抑制作用

为了验证PLEK2的作用是否依赖于PI3K/AKT通路，研究人员使用了PI3K抑制剂LY294002。他们在过表达PLEK2的MCF-7细胞中加入LY294002。结果显示，LY294002本身能够抑制细胞的迁移、侵袭、糖酵解以及AKT的磷酸化。然而，PLEK2的过表达能够部分逆转LY294002带来的这些抑制效应。这一发现表明，PLEK2很可能通过调控PI3K/AKT信号通路来影响乳腺癌细胞的生物学行为。

3.6. PLEK2过表达增强受2-DG影响的MCF-7细胞的迁移和侵袭能力

为了探讨糖酵解过程本身是否对PLEK2促进的迁移和侵袭至关重要，研究人员使用了糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）。实验表明，2-DG处理抑制了MCF-7细胞的迁移和侵袭。然而，在同时过表达PLEK2的细胞中，2-DG的抑制作用被削弱。这说明PLEK2对细胞迁移和侵袭的促进作用至少部分依赖于其增强糖酵解的能力。

3.7. 转录因子HOXD9在调控PLEK2表达中起关键作用

接下来，研究团队探索了是什么因素调控了PLEK2的高表达。他们关注到转录因子HOXD9。当在MCF-7细胞中过表达HOXD9时，PLEK2的mRNA和蛋白水平均显著上升。双荧光素酶报告基因实验显示，HOXD9过表达能显著增强野生型PLEK2启动子的活性，但对突变型启动子无影响。染色质免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）进一步证实，HOXD9抗体能够富集PLEK2启动子区域的特定DNA片段。这些结果确凿地证明HOXD9是PLEK2的直接转录调控因子。此外，功能挽救实验表明，在敲低PLEK2的MCF-7细胞中同时过表达HOXD9，可以恢复因PLEK2缺失而降低的葡萄糖摄取、乳酸和ATP水平以及AKT的磷酸化。

3.8. HOXD9过表达减轻PLEK2敲低的抑制作用，从而增强MCF-7乳腺癌细胞的迁移和侵袭

最后，研究人员验证了HOXD9-PLEK2轴在细胞功能上的重要性。Transwell和划痕实验结果表明，在敲低PLEK2的MCF-7细胞中过表达HOXD9，能够显著恢复细胞的迁移和侵袭能力。这清晰地表明，HOXD9通过上调PLEK2的表达，进而促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

本研究系统地阐明了PLEK2在乳腺癌中的致癌作用。研究发现，PLEK2在乳腺癌中高表达且与患者不良预后相关。功能上，PLEK2通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，上调HIF-1α及其下游糖酵解基因（GLUT1、HK2、LDHA）的表达，从而促进乳腺癌细胞的糖酵解代谢、迁移和侵袭。更重要的是，研究首次揭示转录因子HOXD9是PLEK2的直接上游调控因子，能够结合PLEK2的启动子区域并激活其转录，从而形成了一个新的HOXD9/PLEK2/AKT调控轴。

这项研究的结论具有多重重要意义。首先，它深入揭示了乳腺癌进展的一个新的分子机制，特别是将转录调控、信号通路和细胞代谢紧密联系起来，提供了对乳腺癌生物学更全面的理解。其次，PLEK2被确立为乳腺癌的一个潜在预后生物标志物，其高表达可能提示患者预后较差。最重要的是，该研究指出了HOXD9/PLEK2/AKT信号轴作为一个有前景的治疗靶点。针对这一轴心开发抑制剂，例如靶向HOXD9转录活性或PLEK2功能的药物，可能为乳腺癌患者，尤其是那些具有高表达HOXD9或PLEK2特征的患者，提供新的治疗策略。尽管该研究存在缺乏体内模型和临床样本验证等局限性，但其发现为后续的转化医学研究奠定了坚实的理论基础，并开辟了新的探索方向。