CPT1A K584位点乙酰化通过抑制脂肪酸氧化促进糖尿病肾病肾小管线粒体功能障碍及纤维化

《Biochemical Pharmacology》：Acetylation of CPT1A reduces fatty acid oxidation and leads to dysfunctional renal tubular mitochondria in diabetic kidney disease

本研究聚焦糖尿病肾病（DKD）中肾小管能量代谢紊乱的机制，探讨了肉毒碱棕榈酰转移酶-1A（CPT1A）乙酰化在疾病进程中的关键作用。研究人员通过体内外模型发现，CPT1A在K584位点的乙酰化会抑制脂肪酸氧化（FAO），导致活性氧（ROS）积累和线粒体膜电位降低，进而促进肾间质纤维化。而K584R点突变可逆转上述病理变化。该研究揭示了蛋白质乙酰化修饰调控DKD的新机制，为开发以CPT1A为靶点的治疗策略提供了重要依据。

　　

糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease, DKD）作为糖尿病最严重的微血管并发症之一，是全球终末期肾病的主要诱因。其典型特征包括持续性蛋白尿和肾小球滤过率（GFR）进行性下降。传统观点认为肾小球病变是DKD的核心，但近年研究发现，肾小管损伤和间质纤维化可独立于肾小球病变发生，并且是肾功能恶化的重要驱动因素。肾脏，尤其是富含线粒体的近端肾小管上皮细胞，高度依赖脂肪酸氧化（Fatty Acid Oxidation, FAO）来产生能量。当FAO过程受阻，会导致有毒脂质中间体积累、活性氧（ROS）增多以及线粒体功能紊乱，最终引发肾小管萎缩和间质纤维化。然而，驱动这一系列代谢紊乱的上游分子事件仍未被完全阐明。

蛋白质乙酰化是一种重要的翻译后修饰，通过影响蛋白质的稳定性、定位和相互作用来直接调控酶活性和代谢功能。在代谢性疾病中，许多参与能量代谢的关键酶都会发生乙酰化修饰。肉毒碱棕榈酰转移酶-1A（Carnitine Palmitoyltransferase-1A, CPT1A）是FAO的限速酶，负责将长链脂肪酸转运至线粒体进行β-氧化。已有研究表明CPT1A在慢性肾脏病（CKD）患者中表达下调，但其在DKD中的乙酰化修饰状态及其功能意义尚不清楚。发表在《Biochemical Pharmacology》上的这项研究，由Siyao Sun、Sen Liu、Shiyan Ruan、Hongli Zhou、Xiangfei Cui、Ning Lu、Liu Hong和Miaomiao Lu合作完成，旨在深入探究CPT1A乙酰化，特别是特定赖氨酸位点的乙酰化，在DKD肾小管线粒体功能障碍和纤维化进程中的具体作用和机制。

为了开展研究，作者团队运用了多项关键技术方法。研究采用了db/db小鼠作为体内DKD模型，并利用高葡萄糖（HG）处理的人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）进行体外模拟。通过蛋白质组学范围内的乙酰化修饰谱分析（乙酰化组学）并结合生物信息学分析，系统筛选了DKD中发生显著乙酰化变化的蛋白质和位点。此外，研究还运用了免疫共沉淀（Co-IP）验证特定蛋白的乙酰化水平，并通过慢病毒介导的点突变技术（构建了CPT1A K584R突变体）在细胞水平进行功能获得和功能缺失实验，以探究特定乙酰化位点的功能。对脂肪酸合成酶（FAS）活性、线粒体膜电位和活性氧（ROS）水平的检测则用于评估代谢状态和氧化应激水平。研究还包含了来自医院的患者肾组织活检样本进行免疫组织化学分析。

3.1. 小鼠DKD模型中肾间质纤维化的表征

研究成功构建了db/db小鼠DKD模型。与db/m对照组相比，db/db小鼠表现出典型的多饮、多尿、多食症状，血糖、尿白蛋白/肌酐比值（ACR）和血清肌酐水平均显著升高。肾脏组织病理学染色显示db/db小鼠出现肾小球肥大、系膜基质扩张等病变。Western blotting结果进一步证实，纤维化标志物α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）和纤维连接蛋白（Fibronectin）在db/db小鼠肾脏中表达显著上调，表明模型小鼠存在明显的肾间质纤维化。

3.2. DKD中CPT1A的过度乙酰化

通过乙酰化组学分析，研究人员发现db/db小鼠肾脏中存在广泛的蛋白质过度乙酰化。共鉴定出711个乙酰化位点（涉及599种蛋白质）在db/db小鼠中表达上调超过1.5倍。亚细胞定位分析显示，发生乙酰化改变的蛋白质中有15.79%定位于线粒体。基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析均表明，这些差异乙酰化的线粒体蛋白质显著富集于过氧化物酶体、脂肪酸降解、丁酸代谢等与能量代谢密切相关的通路。值得注意的是，CPT1A是被鉴定出的乙酰化修饰位点最多的线粒体蛋白，共有28个位点发生过度乙酰化，提示其在DKD的代谢紊乱中可能扮演着核心角色。

3.3. CPT1A在DKD中的定位、表达及作用

Western blotting和免疫组织化学染色结果显示，无论是在db/db小鼠还是DKD患者的肾组织中，肾小管上皮细胞内的CPT1A蛋白表达水平均显著下调。在体外实验中，高葡萄糖（30 mM，48 h）处理的HK-2细胞也呈现出CPT1A表达下降以及α-SMA和纤维连接蛋白表达上升的趋势。这些结果将CPT1A的表达下调与DKD中的肾小管纤维化病理过程联系了起来。

3.4. CPT1A K584位点乙酰化促进DKD肾间质纤维化

为了验证乙酰化组学的结果并探究关键位点，研究人员通过免疫共沉淀实验证实了在db/db小鼠肾脏和HG处理的HK-2细胞中，CPT1A确实发生了过度乙酰化。他们重点关注了四个乙酰化水平显著升高的CPT1A位点：K29、K180、K508和K584。其中，K584位点的变化最为显著，且该位点在人和小鼠中进化上高度保守。为了探究K584乙酰化的功能，研究团队构建了CPT1A K584R（模拟去乙酰化）点突变的慢病毒，并转染HK-2细胞。结果显示，与转染空载病毒对照组（LV-NC）相比，在HG条件下，表达K584R突变体的HK-2细胞中α-SMA和纤维连接蛋白的表达水平显著降低。这表明抑制CPT1A在K584位点的乙酰化能够减轻高葡萄糖诱导的纤维化反应。

3.5. CPT1A乙酰化减少脂肪酸氧化并增加氧化应激

机制探索表明，CPT1A的过度乙酰化扰乱了脂肪酸代谢。在db/db小鼠肾脏和HG处理的HK-2细胞中，脂肪酸合成酶（FAS）活性增强，同时伴随着ROS的大量积累和线粒体膜电位的下降，提示FAO受阻和线粒体氧化应激。然而，在转染了CPT1A K584R突变体的HK-2细胞中，HG处理所导致的FAS活性升高、ROS积累以及线粒体膜电位降低等现象均得到显著改善。这说明CPT1A K584位点的特异性去乙酰化能够恢复脂肪酸代谢平衡，减轻线粒体氧化损伤。

综上所述，本研究的结论和讨论部分强调，DKD肾小管中存在广泛的蛋白质过度乙酰化，其中CPT1A是乙酰化修饰最显著的线粒体蛋白之一。CPT1A在K584位点的乙酰化会抑制其介导的脂肪酸氧化，导致脂质毒性中间产物堆积、ROS生成增加和线粒体功能受损，最终驱动肾小管上皮细胞向间质转化和肾纤维化的进程。相反，通过K584R突变模拟去乙酰化，则能增强CPT1A活性，改善脂肪酸氧化，缓解氧化应激和纤维化。这项工作不仅揭示了CPT1A乙酰化作为一种新的翻译后修饰机制在DKD发病中的关键作用，还首次将K584这一特定位点确立为重要的功能调控节点。这些发现为理解DKD的代谢病因学提供了新的视角，并提示以CPT1A K584乙酰化为靶点进行干预（例如开发特异性去乙酰化酶激活剂或模拟去乙酰化的药物），可能成为未来治疗DKD、延缓肾功能衰竭的一种有前景的新策略。