基于微流控技术的乙二醇-海藻糖无DMSO/FBS细胞水凝胶微球冷冻保存新策略

《Biologicals》：Ethylene Glycol and Trehalose Cryopreservation of Cell-Laden Hydrogel Microspheres Enabled by Microfluidic Fabrication

本研究针对细胞负载水凝胶微球缺乏有效冷冻保存方法的难题，开发了微流控制备单分散GelMA/ALG微球技术，并创新性提出无DMSO/FBS的乙二醇-海藻糖(E/T)冷冻保护方案。实验表明该方案可使多种细胞系冻存后存活率>90%，且能维持iPSC多能性，为3D细胞培养技术的临床转化提供了关键技术支撑。

　　

在生物医学研究领域，三维细胞培养技术正日益成为药物筛选、疾病模型构建和再生医学研究的重要工具。与传统二维培养相比，三维培养能更好地模拟体内微环境，使细胞表现出更接近生理状态的行为特征。其中，细胞负载水凝胶微球因其能提供三维支撑结构并实现高通量培养而备受关注。然而，这些活细胞构建体的长期保存却面临重大技术瓶颈——常规冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)和胎牛血清(FBS)可能引起细胞毒性、分化异常等问题，特别是对敏感细胞类型如诱导多能干细胞(iPSC)影响更为显著。

针对这一挑战，江苏大学药学院研究团队在《Biologicals》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种结合微流控制备和无DMSO/FBS冷冻保护剂的完整技术方案。研究人员首先构建了微流控平台用于可控制备单分散的明胶甲基丙烯酰(GelMA)和海藻酸钙(ALG)水凝胶微球，随后系统评估了乙二醇(ethylene glycol)和海藻糖(trehalose)组合(E/T)作为新型冷冻保护剂的性能。

关键技术方法包括：微流控芯片设计制备单分散水凝胶微球；细胞活力检测评估冷冻保护效果；多能性标志物检测验证iPSC特性维持。研究使用人源细胞系(U251、HepG2、A549、GES)和小鼠胚胎成纤维细胞(3T6)以及人诱导多能干细胞(iPSC)作为实验对象。

微流控制备单分散细胞负载微球

通过优化微流控芯片结构和流动参数，研究团队实现了GelMA和ALG微球的高效制备。微球直径变异系数小于5%，保证了实验的重复性和可靠性。封装实验显示，U251细胞在GelMA微球中存活率超过80%，而在ALG微球中，U251和iPSC的存活率均达到90%以上。

E/T冷冻保护剂的优化与验证

研究人员通过系统筛选，确定了12%乙二醇结合4%海藻糖(E/T)的最佳配比。该配方在多种细胞系中表现出色：GES、U251、HepG2、A549和3T6细胞冻存后存活率均超过90%，iPSC也保持了80%以上的存活率。尤为重要的是，与含DMSO方案相比，E/T有效避免了iPSC的凋亡现象。

iPSC多能性维持评估

研究通过多能性标志物检测证实，经E/T方案冻存后的iPSC仍保持完整的多能性特征，Oct4、Sox2、Nanog等关键标志物表达水平与新鲜培养细胞无显著差异，表明该冷冻保存方法不会诱导iPSC发生非定向分化。

讨论与意义

本研究建立的微流控制备结合E/T冷冻保护的技术体系，成功解决了细胞负载水凝胶微球冷冻保存中的关键技术难题。与传统DMSO/FBS方案相比，新方法不仅消除了毒性成分的负面影响，还显著提高了冻存后细胞活力和功能完整性。特别是对iPSC这种对培养条件极为敏感的细胞类型，该方案展现出了独特优势，为干细胞治疗产品的标准化保存和运输提供了可行路径。

这项研究的创新性在于将材料工程、微流控技术和低温生物学有机结合，形成了从制备到保存的完整技术链条。所开发的E/T冷冻保护剂成分明确、安全性高，具有较好的临床转化前景。该技术体系的建立将有力推动3D细胞培养技术在药物开发、疾病建模和再生医学等领域的广泛应用，为生物医学研究提供更加可靠和标准化的工具平台。