光诱导电子转移增强含Ir(III)复合物和羧基荧光素的Bombesin金属肽的肿瘤靶向光动力活性

《Bioorganic Chemistry》：Photoinduced Electron transfer enhances the tumor-targeted photodynamic activity of Bombesin Metallopeptides incorporating an Ir(III) complex and Carboxyfluorescein

本研究针对光动力疗法(PDT)中肿瘤靶向性不足的问题，设计合成了两种新型含末端炔烃的Ir(III)光敏剂(PSs)，并通过点击化学与靶向肽bombesin(BN)衍生物偶联。研究发现复合物1具有纳摩尔级光毒性，可靶向线粒体诱导凋亡。将其与BN3肽偶联获得的金属肽虽降低细胞毒性，但显著提升了对PC3癌细胞的选择性(2-4倍)。特别值得注意的是，同时修饰Ir(III)复合物和羧基荧光素(CF)的双功能金属肽(1-Tr-Lys(CF)-NLS-BN3)通过光诱导电子转移(PeT)机制，实现了荧光淬灭和光动力效应的协同增强，为优化金属基PSs的肿瘤靶向PDT提供了新策略。

　　

癌症治疗一直是医学界面临的重大挑战，传统的化疗方法虽然有效，但往往伴随着严重的全身性毒性反应，这限制了药物剂量并影响了治疗效果。正是在这样的背景下，光动力疗法（PDT）作为一种具有高时空精度的局部治疗手段，受到了越来越多的关注。PDT的核心在于光敏剂（PS），它在特定波长的光照射下，能利用组织中的氧气产生具有细胞毒性的活性氧（ROS），如单线态氧（¹O₂），从而选择性杀伤癌细胞。然而，第一代光敏剂，如基于卟啉的衍生物，存在组织穿透深度浅、光捕获能力差以及肿瘤靶向性不足等局限性，这大大限制了其疗效。

为了克服这些障碍，科学家们将目光投向了新型光敏剂的设计。其中，具有[Ir(C^N)₂(N^N)]⁺通用结构的铱(III)配合物展现出巨大的潜力。它们不仅合成模块化、光物理性质可调，还能高效产生多种ROS，并且具有优异的光稳定性。与此同时，提高光敏剂的肿瘤选择性是增强PDT疗效的关键。一种有效的策略是将光敏剂与能够特异性识别癌细胞表面生物标志物的配体进行偶联。Bombesin（BN）是一种十四肽，其C端序列与胃泌素释放肽（GRPR）具有高度亲和力。GRPR在多种恶性肿瘤（如前列腺癌、乳腺癌等）中过度表达，使得BN成为肿瘤靶向递送放射性药物、化疗药物和成像剂的理想载体。

此前的研究已经开发出一系列BN衍生物，其中肽序列Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH₂（BN3）显示出最有效的肿瘤靶向特性。基于这些背景，由Elisenda Zafon、Gerard Riesco-Llach、Anna Massaguer等人领导的研究团队在《Bioorganic Chemistry》上发表了一项研究，旨在开发新型的、具有增强肿瘤靶向性的Ir(III)光敏剂。他们设计并合成了两种新型的Ir(III)配合物，并将其与BN3肽及其衍生物偶联，构建了一系列金属肽，并深入探究了其光物理性质、体外抗肿瘤活性及作用机制，特别是发现了一种由光诱导电子转移（PeT）介导的协同增效现象。

为开展本研究，研究人员主要应用了几项关键技术：通过有机合成方法制备了含末端炔烃的配体L1及其Ir(III)配合物（1和2）；利用固相肽合成（SPPS）技术合成了BN3靶向肽及其多种衍生物，并通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（点击化学）将Ir(III)配合物与肽链进行位点特异性偶联，构建了13种结构各异的金属肽；采用X射线衍射（XRD）解析了关键配合物的晶体结构；通过紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱、磷光寿命和单线态氧量子产率测定等手段系统表征了光物理性质；利用流式细胞术、共聚焦显微镜、ICP-MS等技术评估了化合物的细胞摄取、亚细胞定位、细胞毒性（MTT法）、线粒体膜电位（JC-1染色）、细胞凋亡（Annexin V/PI染色）和细胞周期影响；并通过酶解实验（使用组织蛋白酶B）和核磁共振（NMR）波谱分析研究了金属肽的结构和构象。

3.1. 配体L1以及复合物1和2的合成与表征

研究人员首先设计并合成了含有末端炔基的配体L1，以便通过点击化学与肽段进行偶联。随后，他们以L1作为二亚胺配体（N^N'），分别与两种不同的环金属化配体（C^N）——2-苯基吡啶（ppy）和2-(2,4-二氟苯基)吡啶（dfppy）的Ir(III)二聚体反应，成功合成了单阳离子配合物[Ir(ppy)₂(L1)]Cl (1)和[Ir(dfppy)₂(L1)]Cl (2)。这两种新配合物均通过核磁共振（NMR）、红外光谱（IR）、高分辨质谱（HRMS）和元素分析进行了充分表征。配合物2的晶体结构通过X射线衍射得以解析，确认了其预期的三齿配位八面体几何构型。

3.3. Ir(III)配合物的光稳定性

光稳定性是光敏剂的一个重要指标。研究人员通过¹H NMR监测了配合物1和2在蓝光（460 nm）照射下的降解情况。结果表明，在经过24小时照射后，两种配合物的光降解率均低于5%，显示出优异的光稳定性，满足PDT应用的需求。

3.4. Ir(III)配合物的吸收和发射光谱及光物理性质

对配合物1和2的光物理性质研究表明，它们在紫外区（<340 nm）有强烈的配体中心（¹LC）吸收带，在可见光区（>340 nm）有较弱的吸收，归属于金属到配体和配体到配体的电荷转移跃迁（³MLCT/³LLCT）。配合物1的发射最大值在480和505 nm，而含氟的配合物2由于配体的吸电子效应，发射蓝移至453和480 nm。配合物1的磷光量子产率（Φ_PL）为7%，激发态寿命（τ）为305 ns；配合物2的Φ_PL低于2%，但寿命更长，达到1328 ns，表明其发射为磷光。

3.5. 光催化产生单线态氧

研究人员使用ABDA（9,10-蒽二基双(亚甲基)二丙二酸）作为¹O₂的特异性捕获剂，评估了配合物1和2产生单线态氧的能力。在蓝光照射下，ABDA的特征吸收峰（379 nm）逐渐降低，表明¹O₂的生成。以玫瑰红（RB, Φ_Δ = 0.76）为参照，计算得出配合物1和2的单线态氧量子产率（Φ_Δ）分别为0.53和0.20，证明它们具有光催化产生¹O₂的能力。

3.6. Ir(III)配合物的内化动力学

通过流式细胞术分析配合物1在A549细胞中的摄取动力学，发现其内化过程在最初2-3小时内呈线性增长，约6小时后达到饱和。因此，后续的光活化实验均采用4小时的预孵育时间，以确保配合物在细胞内的充分积累。

3.7. 复合物1和2的抗癌活性

MTT实验评估了配合物1和2在黑暗和光照条件下对多种癌细胞系（A549, SK-MEL-28, PC-3, BxPC-3）及正常成纤维细胞（MRC-5, 1-BR-3G）的细胞毒性。结果显示，在黑暗条件下，两种配合物均表现出固有的抗癌活性，IC₅₀值在微摩尔范围。经蓝光照射后，配合物1的光毒性显著增强，光毒性指数（PI = IC_{50, 暗} / IC_{50, 光}）达到22-26倍，其IC_{50, 光}值降至低纳摩尔水平。而配合物2的光毒性增强幅度较小（PI = 2-5）。值得注意的是，配合物1对癌细胞的杀伤作用并未表现出对正常细胞的显著选择性。集落形成实验进一步证实，在光活化条件下，低浓度（0.02 μM）的配合物1即可有效抑制A549细胞的长期增殖能力，效果优于高浓度（5 μM）的顺铂。此外，溶血实验表明配合物1在有效浓度下对红细胞没有明显的破坏作用，提示其静脉给药可能具有安全性。

3.8. 亚细胞分布

共聚焦显微镜观察发现，配合物1主要定位于A549细胞的线粒体，这与线粒体膜负电位对阳离子型、疏水性化合物的吸引相一致。其荧光信号与MitoTracker Red染料高度共定位（皮尔逊相关系数0.797），而在细胞核内未检测到信号。

3.9. 线粒体损伤

JC-1染色流式分析表明，经光活化的配合物1处理后的A549细胞，其线粒体膜电位（MMP）显著降低（高MMP细胞比例从65%降至43.6%），而黑暗条件下处理的细胞MMP无显著变化。这证实了配合物1的光动力效应确实导致了线粒体功能损伤。

3.10. 细胞死亡机制

Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）双染色流式细胞术分析显示，光活化后的配合物1能浓度依赖性地诱导A549细胞凋亡，在IC_{50, 光}和5倍IC_{50, 光}浓度下，Annexin V阳性细胞比例分别达到38.0%和70.1%，且大部分凋亡细胞同时呈现PI阳性，提示晚期凋亡或继发性坏死。相比之下，顺铂诱导的凋亡比例较低（12.2%）。细胞周期分析发现，配合物1处理并不引起细胞周期阻滞，这与顺铂（S/G2期阻滞）和多柔比星（G2/M期阻滞）的作用模式截然不同。这表明配合物1的细胞杀伤作用不依赖于直接损伤DNA或干扰细胞周期进程，而是源于其光动力效应所触发的线粒体通路凋亡。

3.11. 肽和金属肽的设计与合成

为了增强配合物1的肿瘤选择性，研究人员将其通过点击化学与不同的BN3衍生物进行偶联，合成了13种金属肽。这些金属肽的设计考虑了多种因素：将Ir(III)配合物连接在肽链N端的α-氨基上（如1-Tr-Lys-BN3）或第一个氨基酸的侧链上（如Nle(Tr-1)-BN3）；引入核定位序列（NLS, Asp-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val）以促进细胞摄取（如1-Tr-Lys-NLS-BN3）；插入可被组织蛋白酶B切割的序列GFLG，以期在溶酶体内释放活性药物（如1-Tr-Lys-GFLG-BN3）；以及构建同时含有Ir(III)配合物和有机荧光团（羧基荧光素CF或罗丹明101 Rhd）的双功能金属肽（如1-Tr-Lys(CF)-BN3），用于示踪或研究能量转移。所有肽和金属肽均通过固相合成法制备，并经HPLC纯化和质谱表征，纯度均高于97%。

3.12. 金属肽的抗癌活性

在GRPR高表达的PC-3前列腺癌细胞中评估了金属肽的活性。总体而言，与游离的配合物1相比，所有金属肽的细胞毒性（无论在黑暗还是光照条件下）均显著降低，IC₅₀值升高了20-146倍，光毒性指数（PI）也相应下降（2.2-3.4）。这可能是由于金属肽通过GRPR介导的内吞作用进入细胞，其效率低于小分子配合物的被动扩散。ICP-MS分析证实，金属肽处理后的PC-3细胞内的铱含量确实远低于游离配合物1处理组。然而，金属肽展现出了对癌细胞的选择性。在非癌性的1-BR-3G成纤维细胞（GRPR阴性）中，金属肽的IC₅₀值通常比在PC-3细胞中高2-4倍，而游离配合物1则无此选择性。特别引人注目的是，双功能金属肽1-Tr-Lys(CF)-NLS-BN3表现出卓越的光动力活性，其IC_{50, 光}值（0.6 μM）比不含CF的类似物1-Tr-Lys-NLS-BN3（5.7 μM）降低了近10倍，PI值高达14.6。而另一个双功能金属肽1-Tr-Lys(CF)-BN3的活性则未增强，甚至略有降低。不含Ir(III)配合物的CF-BN3肽本身无细胞毒性。

3.13. 金属肽的光物理性质

对金属肽的光物理性质研究表明，含有CF的金属肽（1-Tr-Lys(CF)-BN3和1-Tr-Lys(CF)-NLS-BN3）的荧光强度相较于不含Ir(III)的CF-BN3和CF-NLS-BN3肽显著淬灭。同时，含有罗丹明的金属肽1-Tr-Lys(Rhd)-BN3也观察到类似的荧光淬灭现象。由于配合物1的吸收光谱与CF或Rhd的发射光谱重叠很小，研究者排除了荧光共振能量转移（FRET）作为淬灭机制的可能性。

3.14. 通过酶解研究CF发射的淬灭

为了验证荧光淬灭是由于Ir(III)配合物和CF的紧密邻近所致，研究人员合成了金属肽1-Tr-Lys-GFLG-Lys(CF)-BN3，其中Ir(III)配合物和CF被可被组织蛋白酶B切割的GFLG序列分隔开。酶解实验显示，随着酶解时间延长，HPLC-MS检测到Ir(III)配合物从肽链上释放出来，同时溶液的荧光强度恢复了6倍。这直接证明了当Ir(III)配合物和CF在空间上分离时，CF的荧光得以恢复，从而确认了淬灭是由于两者近距离相互作用引起的。

3.15. 金属肽的NMR表征

核磁共振研究表明，无论Ir(III)配合物连接在肽链的哪个位置（N端α-氨基或第一个氨基酸侧链），或者是否连接CF，BN3肽的C端部分（Gln7-Leu13）均倾向于形成α-螺旋结构。对于含有NLS的金属肽，其构象更为复杂，呈现两段α-螺旋中间夹着无规则卷曲和β-转角的结构。比较1-Tr-Lys-NLS-BN3和1-Tr-Lys(CF)-NLS-BN3的芳香区NMR谱图，发现后者的三唑和噻唑环信号有轻微的高场位移，提示CF和Ir(III)配合物的芳香环之间存在π-π堆积相互作用，这可能促进了电子转移过程。研究者推测，1-Tr-Lys(CF)-NLS-BN3和1-Tr-Lys(CF)-BN3活性差异的可能原因之一在于其N端局部构象的不同，影响了CF和Ir(III)配合物之间的相对取向和距离，从而影响了电子转移的效率。

3.16. 关于1-Lys(CF)-NLS-BN3产生¹O₂的机制提议

基于上述实验证据，研究人员提出了一个基于光诱导电子转移（PeT）的机制来解释1-Tr-Lys(CF)-NLS-BN3的荧光淬灭和光动力活性增强现象。该机制包含四个步骤：首先，CF吸收光子跃迁到单重激发态（¹CF）；接着，激发态CF将一个电子转移到邻近的Ir(III)配合物上，生成CF阳离子自由基（CF^+?）和Ir(II)物种；然后，CF^+?和Ir(II)发生电荷复合，由于自旋统计规律，主要生成CF的三重激发态（³CF）；最后，长寿命的³CF*通过能量转移将基态氧（³O₂）活化为单线态氧（¹O₂）。这一机制巧妙地利用了CF优异的光捕获能力和Ir(III)配合物促进系间窜越的特性，通过PeT过程间接生成了更多、寿命更长的CF三重态，从而增强了单线态氧的产生效率和光动力疗效。

本研究成功开发了新型Ir(III)光敏剂及其与肿瘤靶向肽Bombesin的偶联物。研究证实，配合物1本身是一种高效的光敏剂，具有纳摩尔级光毒性、优异的光稳定性和线粒体靶向性，能通过诱导线粒体功能障碍和凋亡来杀伤癌细胞。虽然与BN3肽的偶联普遍降低了金属肽的细胞摄取和光毒性，但成功赋予了其对GRPR阳性癌细胞的选择性杀伤能力。最重要的发现在于，通过巧妙的分子设计，将有机荧光团CF与Ir(III)配合物整合在同一个靶向金属肽上，可以利用两者之间发生的光诱导电子转移（PeT）过程，显著增强其光动力效应。这一策略不仅深化了对金属基光敏剂能量转移过程的理解，而且为开发新一代具有高选择性和高效能的肿瘤靶向光动力治疗药物提供了全新的思路和有力的实验依据。这种“双光敏剂”协同作用的理念，有望在未来推动PDT技术的进一步发展。