综述：现场检测中人畜共患病检测：RPA与CRISPR-Cas的最佳结合

《Biosensors and Bioelectronics》：Zoonotic disease detection at the point-of-care: the best of RPA and CRISPR-Cas

本综述系统探讨了重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas系统结合用于现场（POC）人畜共患病检测的最新进展。文章重点介绍了RPA的低温（37-42°C）、快速（<20分钟）、高灵敏度（低至1拷贝/反应）等优势，及其在解决特异性不足（假阳性率5-10%）时与CRISPR-Cas12/13结合形成的SHERLOCK/DETECTR等平台。同时，综述评估了该技术集成到微型化、便携式诊断平台（如离心、无泵驱动平台）的现状与挑战，并展望了其符合WHO“REASSURED”标准的发展方向，指出其在实现流线型单步反应、集成样品制备及AI辅助分析等方面仍需进一步研究。

　　

人畜共患病现场检测：RPA与CRISPR-Cas的协同作用

引言

人畜共患病，即由动物传染给人类的疾病（如SARS-CoV-2、寨卡病毒、登革热病毒、拉沙病毒、埃博拉病毒、肠炎沙门氏菌等），其快速传播和对医疗、社会及经济的广泛影响，迫切需要在现场检测（Point-of-Care, POC）层面具备快速、特异且灵敏的生物标志物检测工具。核酸（Nucleic Acid, NA）序列作为生物标志物，在实现高灵敏度与特异性方面展现出巨大潜力。然而，实验室金标准方法如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）因其复杂性、高成本和资源密集性，难以在POC场景下广泛应用。等温核酸扩增技术，特别是重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA），以其低温（37-42°C）、快速（5-20分钟）、高灵敏度（检测限低至1拷贝/反应）以及对DNA/RNA模板的兼容性，成为POC应用的优选方案。但RPA存在假阳性率较高（5-10%）的问题，这促使了其与具有高特异性的CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and associated proteins）系统结合，形成了如SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）和DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）等新型生物检测方法。

RPA-CRISPR-Cas生物检测法用于人畜共患病检测

RPA是一种等温DNA扩增技术（图2A），它利用重组酶-引物复合物、DNA聚合酶和单链结合蛋白，无需温度循环即可实现扩增。然而，经典的RPA可能导致非特异性的引物-引物或引物-靶标结合与扩增。为解决此特异性问题，研究团队将RPA与CRISPR-Cas技术（如Cas12或Cas13）相结合。CRISPR-Cas系统在识别特定NA序列后，会激活其非特异性切割活性，从而切割报告分子（如荧光或侧向流动试纸条上的信号分子），实现高特异性的信号读出。这种结合通常以两步法（先RPA扩增，后CRISPR-Cas检测）或一步法（将两个反应整合在同一管中）进行。一步法能减少操作步骤和污染风险，更符合POC需求，但其反应条件的优化更具挑战性。

兼容RPA（-CRISPR-Cas）的平台用于POC人畜共患病诊断

将RPA（无论是否结合CRISPR-Cas）集成到诊断平台中，是实现其POC应用的关键。这些平台旨在满足世界卫生组织“一体健康”倡议和REASSURED标准（实时连接、样本采集简便、经济实惠、灵敏、特异、用户友好、快速稳健、免设备、可交付终端用户）。现有平台主要可分为以下几类：

1. 1.
   微型化实验室平台（MLPs）：这类平台通常需要用户具备一定的实验室操作技能，能够实现较高的通量和多重检测，但便携性和自动化程度可能受限。
2. 2.
   离心平台：利用离心力驱动流体，实现样品制备、扩增和检测的集成，有利于自动化和减少人为误差。
3. 3.
   泵驱动与无泵平台：泵驱动平台能精确控制流体，实现复杂操作；而无泵平台（如基于毛细管作用或蒸发驱动的系统）则结构更简单、成本更低，更适合资源有限的环境。
   这些平台的开发致力于在便携性、多重检测能力、用户友好性和自动化之间取得平衡，以应用于不同的POC场景，如家庭检测（SARS-CoV-2）、医生办公室（mpox诊断）或突发疫情现场。

POC领域的RPA-CRISPR-Cas：一场静待爆发的革命？

过去二十年，RPA已被证明是替代标准NA扩增技术、将人畜共患病检测推向各种POC场景的有力工具。其高灵敏度、多重检测能力、对多种NA靶标的兼容性以及冻干试剂的适用性，使其极具潜力。与CRISPR-Cas的结合更是显著提升了检测的特异性。然而，该技术的成熟度仍然有限。许多方法仍需进一步研究以实现流线型的单步反应，并无缝集成到诊断平台中。此外，尽管已有商业化的尝试，但仍缺乏经过充分验证的平台、集成的样品制备方案，以及能够实现实时流行病学监测的AI驱动结果分析技术。未来的发展需要着眼于解决这些挑战，真正实现符合REASSURED标准的、可用于应对全球健康挑战的创新型诊断工具。

结论

当前的RPA-CRISPR-Cas诊断工具为在分散和资源有限的环境中快速、便携、灵敏且经济有效地检测人畜共患病提供了一项前景广阔的技术。所提出的各种平台形式反映了在便携性、多重检测能力和用户友好性之间取得平衡的努力。多项研究表明，这些技术正日益贴近现实世界的应用需求，但要充分发挥其潜力，仍需在简化操作、集成化和自动化方面持续创新。展望未来，随着技术的不断成熟和优化，RPA-CRISPR-Cas系统有望成为应对新发传染病威胁的强大武器。