双重淬灭和靶向纳米探针，用于实现对肿瘤的灵敏且特异的荧光成像

《Biosensors and Bioelectronics》：Dually quenched and targeting nanoprobe for sensitive and specific fluorescence imaging of tumor

FAPα成像；近红外荧光探针；双重淬灭；双重靶向；肿瘤诊断|

　　在肿瘤学领域，FAPα（成纤维细胞活化蛋白α）作为一种关键的生物标志物，因其在肿瘤微环境中的高度特异性表达而备受关注。FAPα是一种II型跨膜内肽酶，通常在大多数正常组织中几乎检测不到，但在侵袭性恶性肿瘤如胰腺癌和乳腺癌中显著上调（Dakin, 2019; Bhowmick et al., 2004; Kalluri and Zeisberg, 2006）。这种高度选择性的表达模式，使得FAPα成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。同时，FAPα在促进肿瘤增殖、诱导血管生成以及帮助肿瘤逃避免疫监视方面也发挥着重要作用（Geng et al., 2022; Hingorani, 2023; Ji et al., 2016; Quintavalle et al., 2025）。因此，开发出能够灵敏且特异性地检测FAPα活性的成像工具，对于实现肿瘤的早期诊断和深入理解肿瘤发展机制具有重要意义。

目前，用于FAPα成像的技术手段主要包括正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI）。尽管这些技术在临床诊断中具有重要价值，但它们在成本、辐射暴露以及空间和时间分辨率方面存在一定的局限性（Gao et al., 2024; Hu et al., 2025; Wu et al., 2025; Yuan et al., 2019）。相比之下，近红外（NIR）荧光成像因其操作简便、空间和时间分辨率高以及高灵敏度而成为一种极具吸引力的替代方案（Chen et al., 2023; Miao et al., 2023; Weng et al., 2024; Xu, L. et al., 2025; Zhao et al., 2019）。然而，现有的FAPα荧光探针大多是小分子探针，其在灵敏度和特异性方面仍存在不足。这主要是由于两个关键因素：一是由于荧光淬灭不完全导致的持续背景信号；二是由于快速的全身清除导致的肿瘤组织积累不足（Chen et al., 2024; Liu et al., 2022; Miao et al., 2018）。这些限制凸显了开发更先进FAPα荧光探针的迫切需求。

为了解决上述问题，研究团队设计并开发了一种新型的“开启式”纳米探针——NIR-CBT-NP。这种纳米探针具有双淬灭荧光和双靶向能力，能够实现对FAPα的高灵敏度和高特异性成像。NIR-CBT-NP是通过一种称为“点击反应”的化学过程合成的，该过程基于Cys(StBu)-Gly-Pro-Ala-His-Lys(IR780)-CBT（NIR-CBT）这一分子前体。NIR-CBT包含三个关键功能模块：一是位于分子一端的StBu（叔丁基）封端的半胱氨酸（Cys）；二是位于另一端的2-氰基苯并噻唑（CBT）；三是连接在赖氨酸侧链上的近红外荧光团IR780（Wang et al., 2024; Xu, H.-D. et al., 2025）。当NIR-CBT在体内被三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原时，StBu基团被去除，从而激活CBT-Cys的点击反应，形成NIR-CBT-Dimer。这一过程使得IR780荧光团在分子内部发生淬灭。随后，NIR-CBT-Dimer通过非共价相互作用（如π-π堆积）自组装成NIR-CBT-NP，进一步导致荧光团在分子间的淬灭（Du et al., 2020; Xu et al., 2022）。这种“双淬灭”机制有效地降低了初始的背景荧光信号。

在体外实验中，NIR-CBT-NP在FAPα过表达的MIA PaCa-2细胞中表现出显著的信号增强，分别达到13.0倍、3.0倍和4.3倍的增强效果（在FAPα抑制对照组、FAPα过表达细胞以及肿瘤模型小鼠中）。在体内实验中，NIR-CBT-NP首先通过增强渗透性和滞留效应（EPR效应）在肿瘤组织中积累（第一靶向机制），随后在肿瘤微环境中被FAPα特异性切割，转化为NIR-CBT-Cleaved分子（第二靶向机制）。这一结构变化促使NIR-CBT-NP解聚，从而破坏“双淬灭”效应，使近红外荧光信号被激活。这种“开启式”设计不仅提高了信号的灵敏度，还增强了对FAPα的特异性识别能力，从而有效克服了传统小分子探针在肿瘤成像中的不足。

NIR-CBT-NP的设计理念源于对现有技术缺陷的深入分析。传统的荧光探针往往在非靶向区域也存在一定的荧光信号，这不仅影响了成像的准确性，还可能干扰对肿瘤的识别。此外，由于分子体积较小，这些探针在体内的停留时间较短，难以在肿瘤组织中充分积累，从而限制了其成像效果。相比之下，NIR-CBT-NP作为一种纳米探针，其较大的体积有助于在肿瘤组织中停留更长时间，提高成像的对比度和清晰度。同时，其双淬灭机制能够有效抑制背景信号，确保在非靶向区域的荧光信号几乎为零，从而显著提升成像的特异性。

除了在肿瘤成像中的优势，NIR-CBT-NP还表现出良好的生物安全性。在体内的研究结果表明，该纳米探针在多种实验条件下均未表现出明显的毒副作用，这为其在临床应用中的可行性提供了重要保障。此外，其能够通过EPR效应实现高效的肿瘤靶向，这一特性在纳米医学领域具有广泛的应用前景。EPR效应是指由于肿瘤组织的血管结构异常和淋巴系统引流功能受损，导致纳米颗粒在肿瘤组织中更容易积累。这一机制使得NIR-CBT-NP能够在不依赖主动靶向的情况下，实现对肿瘤组织的高效识别。

NIR-CBT-NP的成功开发不仅为FAPα靶向成像提供了一种新的工具，还为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的思路。传统的肿瘤成像方法往往依赖于肿瘤组织的物理特性或代谢特征，而NIR-CBT-NP则能够直接针对FAPα的表达水平进行成像，从而实现对肿瘤的精准识别。这种精准成像对于早期发现肿瘤、评估肿瘤的侵袭性以及监测治疗效果都具有重要意义。此外，NIR-CBT-NP的双靶向能力使其在肿瘤治疗中也具有潜在的应用价值。通过结合EPR效应和FAPα响应性激活，该探针能够在肿瘤组织中实现更高的药物递送效率，从而提高治疗效果。

在实验方法方面，NIR-CBT-NP的合成过程遵循一系列精心设计的步骤，并通过高效液相色谱（HPLC）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）对每一步的产物进行了纯化和表征（图S1–S8）。核磁共振（¹H NMR和¹³C NMR）分析进一步验证了NIR-CBT的成功合成（图S9和S10）。此外，研究团队还通过多种实验手段对NIR-CBT-NP的性能进行了全面评估，包括其在不同条件下的荧光信号变化、在肿瘤组织中的分布情况以及其在体内的代谢行为等。这些实验结果不仅为NIR-CBT-NP的开发提供了科学依据，也为后续的临床转化研究奠定了基础。

从研究结果来看，NIR-CBT-NP在体外和体内的实验中均表现出优异的性能。在FAPα抑制对照组中，NIR-CBT-NP的信号强度显著低于在FAPα过表达细胞和肿瘤模型小鼠中的信号强度，这表明其具有良好的FAPα特异性。同时，其在肿瘤组织中的积累效率和信号增强能力均优于传统的小分子探针，这进一步验证了其在肿瘤成像中的优势。此外，NIR-CBT-NP在体内的生物安全性也得到了充分的验证，这为其在临床中的应用提供了重要的支持。

综上所述，NIR-CBT-NP作为一种新型的FAPα靶向纳米探针，不仅在肿瘤成像中表现出优异的性能，还为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的可能性。其双淬灭机制和双靶向能力使其在灵敏度和特异性方面具有显著优势，同时其良好的生物安全性也为其在临床转化中的应用提供了保障。未来，随着纳米医学和肿瘤成像技术的不断发展，NIR-CBT-NP有望成为一种重要的工具，推动肿瘤研究和临床诊断的进步。