适配体介导的细胞外囊泡洗脱方法比较研究：为下游表征与免疫分析提供优化策略

《Canadian Journal of Chemistry》：Comparison of extracellular vesicle elution methods from aptamer-conjugated magnetic beads for downstream physical characterization and immunoassays

本研究针对适配体亲和色谱中细胞外囊泡（EVs）洗脱方法缺乏系统比较的问题，开展了DNase I与NaCl洗脱效能的对比研究。结果表明，100 U/mL DNase I与1.0 M NaCl均可高效洗脱且保持EVs结构完整性，其中NaCl方案因成本低、蛋白信号强，更适用于免疫检测下游分析，为EVs研究提供了方法学优化依据。

　　

在生命科学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通信的关键载体，其研究价值日益凸显。特别是在疾病诊断和治疗中，EVs携带的蛋白质、核酸等生物分子信息，为无创诊断提供了巨大潜力。然而，如何高效、温和地分离高纯度的EVs，并保持其结构完整性和生物活性，一直是制约其下游应用的瓶颈问题。传统的超速离心等方法虽然常用，但往往效率低且易损伤EVs结构。近年来，适配体（aptamer）亲和色谱技术因其高亲和力、高特异性和温和的洗脱条件，成为EVs分离的新兴策略。但一个关键问题尚未解决：从结合在适配体上的EVs中，选择何种洗脱方法才能平衡洗脱效率、结构保持和下游分析兼容性？这正是本研究旨在回答的核心问题。

为了系统比较不同洗脱方法的效果，Miller等人以卵巢癌细胞系OVCAR-3培养上清来源的EVs为模型，利用抗CD63适配体功能化磁珠进行捕获，随后分别使用不同浓度的氯化钠（NaCl，0.5 M和1.0 M）和脱氧核糖核酸酶I（DNase I，50 U/mL和100 U/mL）进行洗脱。研究团队重点关注了洗脱后EVs的物理特性（如粒径和形态）和蛋白质含量，以评估不同方法对下游分析的影响。

本研究主要依赖于几种关键技术方法：首先，使用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）技术评估洗脱液中EVs的粒径分布和洗脱效率；其次，通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）直观观察洗脱后EVs的形态完整性；最后，利用酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）定量分析EVs表面标志蛋白CD9和表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）的表达水平，以评估洗脱方法对蛋白活性的影响。所有实验均以OVCAR-3细胞培养上清作为EVs来源。

Elution efficiency assessed by dynamic light scattering

通过动态光散射对洗脱效率的定量分析显示，两种洗脱试剂均能有效释放EVs。其中，100 U/mL DNase I处理的洗脱效率最高，达到88%；而1.0 M NaCl也表现出色，洗脱效率为87%，与DNase I组无显著差异。较低浓度的洗脱条件（50 U/mL DNase I和0.5 M NaCl）效率相对较低。DLS结果还表明，洗脱后的EVs其粒径分布与原始EVs样品相似，提示洗脱过程未引起EVs的明显聚集或降解。

EV morphology observed by transmission electron microscopy

透射电子显微镜的形态学观察进一步证实了上述发现。无论采用NaCl还是DNase I洗脱，TEM图像均显示洗脱后的EVs呈现出典型的杯状或球形结构，膜结构完整，未见明显的破裂或变形。这直接证明了两类洗脱方法在有效释放EVs的同时，能够较好地维持其超微结构完整性，为后续的功能研究奠定了基础。

Protein analysis by enzyme-linked immunosorbent assay

对洗脱EVs进行的蛋白质分析揭示了洗脱方法对下游免疫检测的重要影响。ELISA检测结果显示，针对EVs表面蛋白CD9和EGFR，1.0 M NaCl洗脱组获得了最高的信号强度，表明该条件更好地保留了目标蛋白的抗原性和活性。相比之下，尽管DNase I洗脱效率略高，但其ELISA信号相对较低，提示高浓度酶处理可能对某些蛋白表位有轻微影响，或引入了可干扰免疫检测的组分。

综上所述，本研究通过系统比较NaCl和DNase I在适配体介导的EVs洗脱中的性能，得出明确结论：两种方法均能实现高效、温和的EVs洗脱，并保持其物理完整性。其中，100 U/mL DNase I在洗脱效率上略有优势（88%），而1.0 M NaCl则在保证高洗脱效率（87%）的同时，在后续免疫分析（如ELISA）中展现出更优的蛋白检测信号，且其成本低廉、操作简便。因此，对于以蛋白检测和免疫分析为主要下游应用的研究场景，1.0 M NaCl是更具性价比和实用性的洗脱选择。该研究发表于《Canadian Journal of Chemistry》，其意义在于首次为适配体-EVs平台的洗脱方法选择提供了直接、量化的实验证据，强调了根据具体下游分析目标（效率优先还是蛋白活性优先）优化洗脱策略的重要性，对推动EVs在生物标志物发现和液体活检领域的标准化应用具有重要的方法论指导价值。