镁掺杂生物活性玻璃通过逆转人牙髓干细胞复制性衰老增强骨再生

《Regenerative Biomaterials》：Magnesium-Doped Bioactive Glass Enhances Bone Regeneration by Reversing Replicative Senescence of Human Dental Pulp Stem Cells in Bone Defect Therapy

本研究针对体外扩增导致的人牙髓干细胞(hDPSCs)复制性衰老及成骨分化能力下降这一瓶颈问题，开发了梯度镁掺杂生物活性玻璃(Mg-BG)，发现20 mol% MgO掺杂的20Mg-BG可有效逆转hDPSCs衰老表型，通过调控IKBKGP1介导的NF-κB通路改善线粒体功能、降低ROS水平，显著增强衰老细胞的成骨分化能力及体内颅骨缺损修复效果，为干细胞衰老干预及骨再生材料设计提供了新策略。

　　

在骨组织工程领域，间充质干细胞(MSCs)因其强大的成骨分化能力被视为理想的种子细胞。其中人牙髓干细胞(hDPSCs)因来源丰富、获取便捷而备受关注。然而临床应用中需要大量细胞，hDPSCs需经体外扩增才能满足需求，而多次传代会导致复制性衰老——细胞停止分裂、功能衰退，特别是成骨分化能力显著下降，这成为制约其临床转化的主要瓶颈。

镁离子(Mg²⁺)作为人体内含量最丰富的二价阳离子之一，在骨代谢和衰老过程中扮演关键角色。研究表明镁缺乏与骨脆性和多种衰老相关疾病密切相关。但镁离子对MSCs复制性衰老的影响尚不明确。为此，中山大学口腔医院的研究团队在《Regenerative Biomaterials》上发表研究，开发了镁掺杂生物活性玻璃(Mg-BG)材料，系统探究了其对hDPSCs复制性衰老的逆转作用及机制。

研究采用溶胶-凝胶法制备了五种不同镁掺杂比例(0-36 mol%)的Mg-BG粉末，通过表征确认材料具有介孔结构，其中15Mg-BG和20Mg-BG比表面积最大(约260 m²/g)。离子释放实验显示所有组别Mg²⁺浓度维持在0.5-1.5 mM生理范围。

关键技术方法包括：从16-22岁捐赠者牙齿中分离hDPSCs，建立P4(年轻)和P10(衰老)细胞模型；通过SA-β-gal染色、qRT-PCR、Western blot评估衰老标志物；采用CCK-8、ALP/ARS染色、流式细胞术分析细胞功能；建立大鼠颅骨缺损模型进行体内验证；通过RNA-seq筛选关键通路。

Mg-BG表征结果显示梯度掺杂效果

扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)显示所有Mg-BG样品均由纳米组分形成不规则多边形微米颗粒，具有多孔结构和粗糙表面。X射线衍射(XRD)表明除0Mg-BG外，其余组均呈非晶态。傅里叶变换红外光谱(FTIR)显示所有组在1090 cm^-1(Si-O-Si键)和560-603 cm^-1(P-O键)处特征峰相似，证明镁掺杂未改变基本化学结构。

离子释放行为与孔隙结构相关

氮吸附-脱附等温线显示所有Mg-BG均为IV型吸附曲线和H3型滞后环，符合介孔材料特征。随着镁掺杂量增加，比表面积和孔径先增大后减小，15Mg-BG和20Mg-BG具有最大孔径(29.2 nm)和比表面积。在14天释放期内，20Mg-BG组Mg²⁺浓度稳定在1.0-1.2 mM，Ca²⁺浓度维持在0.4-0.6 mM，pH值稳定在7.3-7.5，呈现理想的缓释特性。

成功建立hDPSCs复制性衰老模型

研究人员通过形态观察、表面标志物检测(CD90/CD105/CD106/CD146阳性，CD45/CD14阴性)和成骨诱导验证hDPSCs特性。随着传代次数增加(P4→P10)，细胞形态变扁平，SA-β-gal阳性率显著升高，衰老相关基因p16、p21、p53表达上调，成骨标志物ALP、COL1、RUNX2表达下降，ARS染色显示矿化结节形成减少，证实P10细胞具备典型衰老特征。

20Mg-BG有效逆转细胞衰老表型

CCK-8实验显示20Mg-BG提取物显著促进hDPSCs增殖。SA-β-gal染色显示20Mg-BG处理组阳性细胞比例较P10组下降约50%。qRT-PCR和Western blot结果一致表明，20Mg-BG显著降低p16和p21表达，但对p53影响不大，说明其特异性缓解复制性衰老而非应激性衰老。值得注意的是，Mg-BG对SASP成分IL-6、IL-8的表达无显著影响，提示其抗衰老机制可能不依赖于炎症因子调控。

改善线粒体功能与表面标志物表达

JC-1染色显示20Mg-BG处理显著提升线粒体膜电位(MMP)，流式细胞术证实ROS水平降低约30%。同时，与细胞分化、迁移、粘附相关的表面标志物CD90、CD106、CD146表达显著上调。特别值得注意的是，36Mg-BG组虽然Mg²⁺浓度最高，但对线粒体功能的改善效果反而下降，提示Mg²⁺/Ca²⁺平衡比单一离子浓度更重要。

显著增强成骨分化能力

ALP染色显示20Mg-BG处理7天后，衰老hDPSCs的碱性磷酸酶活性恢复至年轻细胞水平。培养21天后，ARS染色显示20Mg-BG组矿化结节面积较P10组增加约3倍。qRT-PCR和Western blot证实成骨相关基因RUNX2、COL1、OCN和牙源性标志物DSPP表达显著上调，其中20Mg-BG组效果最优，明显优于阳性对照MTA组。

促进体内骨缺损修复

大鼠颅骨缺损模型显示，20Mg-BG+hDPSCs(P10)组修复效果最佳：Micro-CT显示骨体积分数(BV/TV)显著提高，骨小梁数量(Tb.N)和厚度(Tb.Th)增加，分离度(Tb.Sp)减小。H&E染色显示新生骨组织面积最大，免疫组化证实COL1、RUNX2、OCN表达强烈。值得注意的是，RUNX2在骨陷窝内细胞核中的定位比例显著高于P10组，表明成骨细胞活性增强。

IKBKGP1-NF-κB通路的关键作用

RNA-seq分析发现，与P10组相比，20Mg-BG组有66个基因下调、32个基因上调，其中21个基因与P4/P10差异表达基因重叠。KEGG分析显示泛素化调节的蛋白质代谢通路富集显著。特别值得注意的是，IKBKG伪基因1(IKBKGP1)在衰老细胞中表达显著上调，而20Mg-BG处理使其恢复至年轻水平。IKBKGP1与IKKγ亚基相关，可能通过调节IKK复合体泛素化影响NF-κB通路。

qRT-PCR验证显示，20Mg-BG显著抑制NF-κB通路关键基因RelA、p50、RelB、IKKβ和TRAF6的表达，对p52影响不大。这表明20Mg-BG可能通过抑制IKBKGP1表达，减少IKKγ泛素化激活，进而抑制RelA/p50二聚体核转位，最终下调p21等衰老相关基因表达。

本研究首次揭示Mg-BG通过调控IKBKGP1-NF-κB轴逆转hDPSCs复制性衰老的分子机制，为开发抗衰老生物材料提供了新思路。20Mg-BG不仅恢复了衰老细胞的成骨功能，还改善了线粒体代谢状态，这种多靶点作用特点使其在骨组织工程中具有广阔应用前景。该研究将材料科学与干细胞生物学相结合，为解决MSCs体外扩增瓶颈提供了创新性解决方案。