NMN通过激活NAD+/Sirt1/FOXO1a通路修复邻苯二甲酸二丁酯诱导的血脑屏障损伤

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Nicotinamide mononucleotide rescues Di-n-butyl phthalate induced blood-brain barrier damage via NAD+/Sirt1/FOXO1a pathway activation

本研究针对环境污染物邻苯二甲酸二丁酯（DBP）诱导神经毒性及血脑屏障（BBB）损伤的机制不明问题，探讨了DBP通过耗竭NAD+抑制Sirt1/FOXO1a通路破坏BBB完整性的新机制，并首次证实补充烟酰胺单核苷酸（NMN）可有效逆转该损伤。研究通过体内外实验证实NMN能恢复NAD+水平、激活Sirt1/FOXO1a通路、改善线粒体功能并减轻神经炎症，最终恢复认知功能，为环境神经毒性的防治提供了新靶点。

　　

在我们日常生活中，塑料制品无处不在，从食品包装到个人护理用品，它们为现代生活带来了便利，但同时也潜藏着健康风险。其中，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）作为一种常见的塑化剂，被广泛用于增加塑料的柔韧性。然而，这种化学物质可能从产品中渗出，进入环境和食物链，最终在人体内累积。已有研究表明，DBP暴露与神经毒性有关，可能导致认知功能下降，但其具体机制，尤其是对保护大脑的关键结构——血脑屏障（BBB）的影响，尚不明确。血脑屏障是大脑的“守门人”，由脑微血管内皮细胞等构成，能选择性控制物质进出脑组织，维持中枢神经系统稳定的内部环境。当血脑屏障完整性遭到破坏，有害物质便可能趁虚而入，引发神经炎症和神经元损伤。因此，探究DBP如何影响血脑屏障，并寻找有效的干预措施，对于预防环境污染物引起的神经疾病具有重要意义。这项发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上的研究，正是为了解开这个谜团。

研究人员为阐明DBP对血脑屏障的影响及干预策略，综合运用了多项关键技术。他们使用C57BL/6小鼠构建了体内DBP暴露模型，并通过尾静脉注射伊文思蓝染料评估血脑屏障通透性。采用组织病理学染色（H&E和尼氏染色）观察脑组织形态变化。利用转录组测序（RNA-seq）技术筛选差异表达基因并进行通路富集分析。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子水平。建立了人脑微血管内皮细胞（HBMEC）体外血脑屏障模型，通过跨膜通透性实验、细胞活力检测（CCK-8法）、线粒体膜电位（JC-1染色）和活性氧（ROS）测定评估细胞功能。并运用蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光染色技术分析关键蛋白表达。

3.1. DBP暴露破坏小鼠血脑屏障完整性，诱导神经炎症和神经元损伤

研究人员首先给小鼠灌胃500 mg/kg的DBP。结果发现，与对照组相比，DBP处理组小鼠大脑皮层中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著升高。伊文思蓝染料渗出实验表明，DBP暴露显著增加了血脑屏障的通透性。组织学检查显示，DBP组小鼠皮层神经元出现结构改变和核固缩，尼氏染色则揭示了明显的神经元损伤。进一步蛋白质分析表明，紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量在DBP组显著降低。这些结果证实，DBP暴露确实破坏了血脑屏障的完整性，并引发了神经炎症和神经元损伤。

3.2. DBP在体外诱导内皮细胞损伤和屏障功能障碍

为了在细胞水平验证DBP的毒性，研究团队使用了人脑微血管内皮细胞（HBMEC）构建体外血脑屏障模型。CCK-8实验显示，DBP以剂量和时间依赖的方式降低细胞活力，并伴随一氧化氮（NO）释放和环磷酸鸟苷（cGMP）水平的下降。DBP暴露还引发了HBMEC的炎症反应，表现为IL-1β、TNF-α和乳酸脱氢酶（LDH）水平的升高。线粒体功能检测发现，DBP处理导致线粒体膜电位下降和活性氧（ROS）积累，表明线粒体受损。此外，跨膜通透性实验证明DBP增加了HBMEC单层的通透性。蛋白质印迹和免疫荧光结果一致显示，ZO-1和Occludin蛋白表达下调。这些体外实验结果表明，DBP直接损害了脑微血管内皮细胞的功能和屏障特性。

3.3. DBP暴露通过NAD⁺耗竭和Sirt1/FOXO1a通路改变破坏血脑屏障

为了探究DBP损伤血脑屏障的分子机制，研究人员对小鼠皮层组织进行了转录组测序分析。结果显示，DBP处理组有65个基因下调，7个基因上调。其中，Sirt1的表达显著降低。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，差异表达基因显著富集于FOXO信号通路。基因本体论（GO）分析提示，DBP影响了多种线粒体功能。鉴于Sirt1的酶活性依赖于NAD⁺，研究人员检测了脑组织中的NAD⁺浓度，发现DBP暴露导致NAD⁺水平显著下降。蛋白质分析进一步证实，Sirt1及其下游靶点FOXO1a的蛋白表达量在DBP组均降低。这些发现表明，DBP可能是通过耗竭NAD⁺、抑制Sirt1/FOXO1a通路来破坏血脑屏障完整性。

3.4. NMN干预逆转DBP诱导的血脑屏障损伤

接下来，研究人员探讨了补充NAD⁺的前体物质——烟酰胺单核苷酸（NMN）是否能挽救DBP造成的损伤。结果显示，NMN治疗降低了脑组织中的炎症因子水平，减少了伊文思蓝染料的渗出，并改善了皮层神经元的形态。更重要的是，NMN补充恢复了脑内的NAD⁺浓度。在机制上，NMN处理逆转了ZO-1、Occludin、Sirt1和FOXO1a蛋白的表达下调。这些结果说明，NMN通过补充NAD⁺、重新激活Sirt1/FOXO1a通路，来减轻DBP诱导的血脑屏障破坏和神经炎症。

3.5. NMN减轻DBP诱导的内皮细胞毒性和线粒体损伤

为了确认Sirt1在NMN保护作用中的关键角色，研究者在HBMEC中使用了Sirt1特异性抑制剂EX-527。CCK-8实验表明，抑制Sirt1活性抵消了NMN对细胞活力的保护作用。NMN改善线粒体功能（表现为膜电位恢复和ROS减少）和降低细胞单层通透性的效应，也在EX-527存在时被废除。蛋白质分析显示，NMN对紧密连接蛋白和Sirt1/FOXO1a通线的上调作用依赖于Sirt1的活性。这些体外实验证实，NMN主要通过激活Sirt1/FOXO1a通路来对抗DBP引起的内皮细胞损伤。

3.6. NMN对DBP暴露小鼠认知功能恢复的影响

最后，研究评估了NMN对行为学的影响。病理分析显示，NMN治疗减轻了DBP引起的海马神经元损伤。在莫里斯水迷宫测试中，NMN处理的小鼠表现出更好的空间学习记忆能力，其逃避潜伏期缩短，在目标象限的停留时间和穿越平台次数增加。旷场实验表明，NMN还改善了小鼠的焦虑样行为和自主活动能力。这些行为学结果证实，NMN能够缓解DBP暴露导致的认知缺陷。

本研究系统阐明了环境污染物DBP损害血脑屏障并导致认知功能障碍的新机制。研究首次揭示，DBP通过耗竭脑内NAD⁺，抑制了Sirt1/FOXO1a这一关键信号通路的活性，进而破坏紧密连接蛋白表达、引发线粒体功能障碍和神经炎症，最终损害血脑屏障完整性。更为重要的是，研究创新性地发现补充NMN能够有效逆转上述病理过程。NMN作为NAD⁺的前体，成功提升了脑内NAD⁺水平，重新激活了Sirt1/FOXO1a通路，从而修复血脑屏障、减轻神经炎症并改善认知功能。该研究不仅深化了对环境神经毒性机制的理解，更重要的是为防治由塑化剂等环境污染物引起的神经血管损伤提供了潜在的干预策略，将环境毒理学与精准神经保护策略联系起来，具有重要的科学意义和潜在的应用价值。