环境内分泌干扰物通过免疫与线粒体通路影响阿尔茨海默病的多组学遗传证据

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Endocrine disruptors, immune dysregulation, and Alzheimer's disease: A multi-omics approach to uncovering environmental neurogenetics

本研究针对环境内分泌干扰物（EDC）与阿尔茨海默病（AD）因果关联不明的科学问题，通过整合化学-基因互作数据库、血液cis-eQTL数据和GWAS汇总统计，采用孟德尔随机化（MR）与贝叶斯共定位分析，发现27个EDC调控基因与AD风险显著相关，其中12个基因（如CCNE2、SEMA4G、NDUFS2）与AD风险位点存在强共定位证据。功能富集显示这些基因主要参与自然杀伤细胞毒性、线粒体核糖体通路等免疫与线粒体功能。单细胞RNA测序进一步揭示共定位基因在AD患者外周免疫细胞亚群中差异表达。该研究为EDC通过免疫与线粒体失调影响AD发病提供了遗传证据，为环境因素驱动的神经退行机制研究开辟了新视角。

　　

在全球人口老龄化的浪潮中，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）作为一种渐进性神经退行性疾病，已成为老年人致残和死亡的主要原因之一。尽管像APOE ε4这样的遗传因素已被确认为AD的重要风险因子，但它们并不能完全解释疾病的遗传性。越来越多的证据表明，环境暴露，特别是生命早期或长期慢性暴露，可能在调节AD风险和进展中扮演关键角色。然而，连接环境因素与AD的潜在生物学机制至今仍不甚明了。

在众多环境因素中，内分泌干扰化学物（Endocrine-Disrupting Chemicals, EDCs）是一类广泛存在于消费品和工业废物中的外源性化合物，它们能够干扰内分泌系统和激素信号通路。这类化学物质包括塑料中的双酚A（BPA）和邻苯二甲酸酯、农药、工业废物和阻燃剂等。新兴的毒理学和流行病学研究提示，EDCs可能通过破坏激素稳态、诱导氧化应激、促进神经炎症、引起线粒体功能障碍以及干扰神经营养信号通路等多种非遗传机制参与神经退行过程。例如，双酚A（BPA）和四溴双酚A（TBBPA）等化合物在实验模型中已被证明会损害神经元活力和突触功能。此外，几种EDCs也与神经发育障碍和认知障碍有关。这些发现暗示了EDC暴露与AD等神经退行性疾病之间存在合理的联系，尽管这种关系的因果性质尚未得到严格证实。

尽管关注日益增长，但大多数探索EDCs在AD中作用的研究本质上是观察性的，这限制了其推断因果关系和厘清复杂基因-环境相互作用的能力。此外，关于EDCs是否可能通过改变基因表达来调节AD风险，以及这种效应是否由遗传调控所介导，人们知之甚少。近年来，孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）和共定位分析方法已成为利用遗传变异作为工具变量推断因果关系的强大工具。这些方法为评估EDCs调控的基因是否与AD存在因果联系，以及基因表达和疾病易感性背后是否存在共享的遗传位点提供了机会。

在此背景下，研究人员开展了一项系统的研究，通过整合大规模化学-基因相互作用数据、表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）数据集和AD的全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）汇总统计数据，来研究EDC调控的基因表达是否与AD风险存在因果关联。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，从TEDX和CTD数据库识别EDC相关基因并构建互作网络；其次，利用eQTLGen联盟提供的血液cis-eQTL数据（样本量31,684，欧洲 ancestry）以及EADB和IGAP联盟的AD GWAS汇总统计数据（最大样本量达789,000余人），应用两样本MR分析评估EDC调控基因表达对AD风险的因果效应；接着，采用贝叶斯共定位分析（coloc R包）优先确定共享因果变异的基因；然后，通过Metascape平台进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析以阐明相关生物学通路；最后，利用来自GEO数据库（GSE181279）的外周血单核细胞（PBMC）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（包含3例AD患者和2例健康对照），在Seurat环境中进行细胞聚类和差异表达分析，以揭示共定位基因在特定免疫细胞亚群中的表达模式。

3. 结果

3.1. EDC调控基因对AD风险的因果效应

MR分析利用EADB联盟的GWAS汇总统计数据，评估了EDC调控基因表达对AD的因果效应。该分析确定了27个与AD风险显著相关的基因（FDR < 0.05）。其中，如CCNE2、HLA-E和CDK10等基因显示出正相关，表明其表达增加可能提升AD易感性；而如SERPINB9、NDUFS2和APP等基因则呈负相关，提示其可能具有保护作用。对于具有多个工具变量（IVs）的基因，五种MR方法的结果均显示一致的作用方向。敏感性分析未发现水平多效性或异质性的证据。留一法分析进一步证实了结果的稳健性，显示没有单个SNP对总体因果估计产生不成比例的影响。

3.2. 生物学通路富集

对显著的因果性EDC调控基因进行功能富集分析，发现在多个免疫相关和线粒体通路中存在显著富集。最显著富集的GO生物学过程包括自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性的调节和有丝分裂细胞周期的正调控，提示其在免疫监视和细胞增殖中的潜在作用。线粒体功能也被凸显，55S线粒体核糖体复合物是顶级的CORUM富集条目之一，表明线粒体蛋白质合成与AD病理之间存在可能的联系。此外，Reactome通路分析揭示了膜运输和RHO GTP酶循环的显著富集，这些通路参与细胞内信号传导和细胞骨架组织。另一个免疫相关的GO术语，免疫反应调节细胞表面受体信号通路，进一步支持了EDC诱导的AD风险背后的免疫遗传学成分。

3.3. 因果基因效应的复现与荟萃分析

为验证EDC调控基因对AD的因果效应，研究人员在IGAP队列中对EADB基础MR分析中显示显著关联的27个基因进行了复现分析。其中MRPL41、VEGFB和COG7因在IGAP中缺乏足够SNP而被排除。在剩余的24个基因中，数个基因，如NDUFS2、SEMA4G、CCNE2、KNOP1和MAFK，在IGAP中表现出一致的效应方向和统计学显著性，强化了它们在AD易感性中的潜在作用。对于具有多个IVs的基因，五种MR方法的结果均显示一致的作用方向。敏感性分析未发现水平多效性或异质性的证据。留一法分析进一步证实了结果的稳健性。随后，使用随机效应模型对EADB和IGAP的估计值进行了荟萃分析。这种整合方法确认了多个基因的稳健关联，包括SEMA4G和CCNE2，加强了它们因果参与的证据。

3.4. 与AD共定位的EDC调控基因的优先排序

为识别那些表达很可能受与影响AD风险相同的变异所调控的基因，研究人员进行了共定位分析。基因根据假设4的后验概率（PP·H4）进行优先排序，该概率表示基因表达与AD风险之间存在共享的因果变异。使用PP·H4 > 0.80的阈值来定义强共定位证据。12个基因显示出强共定位信号，表明相同的遗传变异可能影响其表达和AD易感性。其中，MRPL41、NDUFS2和SEMA4G表现出最高的共定位概率，支持其调控表达和AD风险具有共享的遗传基础。其他值得注意的基因包括CCNE2、KNOP1和MRPS17，进一步强化了EDC暴露与AD之间的遗传联系。

3.5. 连接EDCs与共定位AD基因的相互作用网络

为阐明连接EDCs与AD的潜在机制，研究人员将CTD中经过人工审编的化学-基因相互作用信息映射到具有强共定位证据的EDC调控基因上。这凸显了特定EDCs与AD相关基因之间复杂的连接网络。几种EDCs表现出特别高的连接度，表明它们可能调控多个AD相关基因，并作为核心的环境调节因子。这些高度连接的化学物质涵盖了不同的化学类别，包括双酚类、重金属、持久性有机污染物（POPs）和多环芳烃（PAHs）。其中，BPA、砷酸钠和氯化镉成为关键枢纽，每种都与多个基因相互作用。

3.6. 共定位基因在免疫细胞亚群中的外周血scRNA-seq分析

为检查共定位的EDC调控基因的细胞类型特异性表达模式，研究人员分析了来自3例AD患者和2例认知健康对照（HC）的外周血单核细胞（PBMC）的scRNA-seq数据。质量控制后，从五个样本中保留了总共27,244个细胞，无监督聚类识别出15个不同的簇，被注释为五种主要免疫细胞类型：CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD8⁺ NKT细胞和B细胞。细胞类型组成在AD和健康对照之间存在显著差异。AD样本显示出更高比例的CD4⁺ T细胞和更少的NK细胞，提示AD中存在免疫失调。接下来，研究人员检查了通过MR和共定位分析确定的12个共定位基因的表达谱。其中11个基因在单细胞RNA-seq数据集中被检测到并纳入下游分析。点图揭示了跨免疫细胞类型的 distinct 表达模式。值得注意的是，NDUFS2和MRPL41在NK和NKT细胞中高表达，而ST13在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中高表达。UMAP特征图进一步代表性显示了NDUFS2、MRPL41和ST13在免疫细胞簇内的强表达，支持它们在AD进展过程中外周免疫调节中的相关性。

4. 讨论与结论

本研究通过整合多组学数据与因果推断框架，为EDC暴露与AD风险之间的关联提供了新颖的遗传证据。讨论部分重点阐释了因果基因的功能、相关通路、关键EDC类别的机制见解以及研究的转化意义。

在确定的因果基因中，SEMA4G（信号素4G）作为轴突导向和神经元回路形成的关键调节因子，其上调可能通过影响神经炎症和免疫反应加剧AD病理。CCNE2（细胞周期蛋白E2）作为细胞周期G1/S期转换的调控因子，其异常表达可能驱动神经元异常细胞周期重入，从而导致凋亡。相反，NDUFS2（NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基S2）作为线粒体复合物I的核心组分，其上调可能增强线粒体韧性，对抗AD中的代谢和氧化应激，发挥保护作用。其他基因如KNOP1、MAFK、MRPL41和MRPS17等则分别在线粒体稳态、氧化应激反应、线粒体核糖体生物合成等过程中发挥作用，共同构成了EDC影响AD的复杂网络。

功能富集和单细胞转录组分析共同指向了AD发病机制中外周免疫失调与线粒体功能障碍之间的引人注目的交汇点，这可能是由EDC调控的基因表达所介导的。自然杀伤（NK）细胞毒性、免疫受体信号通路等免疫相关通路的显著富集，以及NDUFS2、MRPL41等基因在NK、NKT等免疫细胞中的特异性表达，提示EDC暴露可能重塑外周免疫功能，进而通过系统免疫激活影响中枢神经系统稳态。同时，线粒体核糖体组分和氧化磷酸化相关基因的富集表明，EDC诱导的能量代谢受损可能与免疫功能障碍紧密相关。线粒体功能对免疫细胞活化、迁移和细胞因子产生至关重要，因此，外周免疫细胞中的线粒体应激可能放大系统炎症并加速神经退行过程。这种对免疫调节和能量平衡的双重影响，可能是EDCs对AD风险产生长期影响的关键机制轴心。

通过对化学-基因相互作用网络的分析，研究识别出了几类与AD相关基因相互作用密切的EDCs，并对其机制和暴露相关性进行了深入讨论。双酚类化合物（如BPA、BPS等）作为广泛存在的环境雌激素，可通过诱导氧化应激、损害线粒体动力学和破坏突触可塑性直接产生神经毒性。重金属（如砷、镉、铜）具有生物累积性，与线粒体功能障碍、炎症和DNA损伤过程相关，这些过程与AD的分子特征大量重叠。持久性有机污染物（POPs）和多环芳烃（PAHs）（如DDE、TCDD、苯并[a]芘、PFOA等）具有环境持久性，可作为AhR受体配体等途径改变大脑基因表达模式、促进神经炎症状态。这些不同类别化学物质的共同点在于其持久性、生物累积性以及触发炎症和代谢功能障碍的能力，这些都是神经退行的重要贡献者。

本研究结果对临床研究和公共卫生具有重要启示。在临床方面，识别出的具有AD潜在因果作用的EDC调控基因为早期诊断生物标志物和治疗靶点提供了新的候选对象。免疫和线粒体通路的参与表明，靶向外周免疫调节或线粒体功能可能为疾病修饰提供新途径。在公共卫生方面，该研究凸显了环境化学物暴露，尤其是普遍存在于消费品和工业污染物中的EDCs的潜在神经退行性后果。这强调了评估和规范此类化学品长期人体暴露的紧迫性，并支持需要制定综合卫生政策，将环境风险因素视为AD的可改变贡献者。旨在减少EDC暴露的预防策略可能为降低AD的社会负担提供补充途径。

研究人员也客观指出了本研究的局限性，包括遗传调控的组织特异性（使用外周血eQTL和scRNA-seq数据）、化学-基因相互作用数据的暴露相关性局限、人群祖先单一（欧洲 ancestry）带来的普适性问题，以及因果推断仍需实验验证等。未来的研究方向包括利用脑组织特异性eQTL数据、整合生物监测数据或概率暴露模型、开展多祖先群体研究，以及通过体外和体内实验进行功能验证。

总之，这项研究通过创新的多组学整合分析框架，为EDCs可能通过免疫和线粒体失调影响AD发病风险提供了强有力的遗传学证据。它不仅揭示了特定的候选基因和通路，还强调了环境因素在神经退行性疾病中的重要角色，为理解基因-环境相互作用开辟了新视角，并对AD的预防、早期诊断和干预策略具有潜在的转化价值。该论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》期刊。