益生菌Limosilactobacillus reuteri γ-碳酸酐酶的功能解析与靶向激活策略：从晶体结构到细胞水平的新见解

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Production, Crystallographic Studies, and Functional Profiling of γ-Carbonic Anhydrase from the Probiotic Limosilactobacillus reuteri: In Vitro and Cell-Based Insights

本研究针对如何特异性调控益生菌功能以增强其益生效果这一关键问题，首次对益生菌Limosilactobacillus reuteri的γ-碳酸酐酶(LreCAγ)进行了重组生产、晶体结构解析和功能表征。研究发现LreCAγ对经典抑制剂磺胺类的敏感性较低，但可被多种氨基酸有效激活，其中L-组氨酸和L-色氨酸表现尤为突出。在细胞模型中，L-色氨酸不仅能减弱LPS诱导的巨噬细胞活化，还展现出良好的肠上皮细胞生物相容性。这项研究为通过特异性激活益生菌CA来增强其功能提供了新思路，对开发针对肠道菌群失调的干预策略具有重要意义。

　　

在人体这个复杂的生态系统内，肠道微生物群扮演着至关重要的角色，它们不仅参与消化吸收，还深刻影响着宿主的免疫调节、代谢平衡甚至神经系统功能。其中，益生菌作为有益微生物的代表，近年来因其在维持肠道健康、预防和治疗多种疾病方面的潜力而备受关注。然而，面对复杂的肠道环境和多变的宿主反应，如何有效增强益生菌的定植效率、稳定性和功能表现，已成为当前益生菌研究领域的核心挑战。

传统上，针对细菌感染的治疗策略往往聚焦于开发抗菌药物，但这类广谱性药物在清除病原体的同时，也常常会误伤肠道中的有益菌群，导致菌群失调。有没有一种更精准的方法，能够特异性增强益生菌的活力，而不影响其他微生物呢？意大利佛罗伦萨大学的研究团队将目光投向了碳酸酐酶（CA）这一关键酶家族。碳酸酐酶是催化二氧化碳可逆水合反应的金属酶，在细菌的生存、环境适应和致病性中发挥重要作用。虽然针对病原菌CA的抑制剂研究已取得进展，但关于益生菌CA的功能及其调控策略却鲜有报道。

在这项发表于《European Journal of Medicinal Chemistry》的研究中，研究人员首次对益生菌Limosilactobacillus reuteri的γ-碳酸酐酶（LreCAγ）进行了全面系统的研究。他们采用重组DNA技术成功表达并纯化了LreCAγ蛋白，通过X射线晶体学解析了其高分辨率三维结构，并利用停流光谱技术系统评估了该酶的动力學参数、抑制和激活特征。此外，研究还结合大肠杆菌模型评估了CA激活剂对细菌生长的影响，并在人巨噬细胞和肠上皮细胞中检验了选定激活剂的抗炎活性和生物相容性。

研究的关键技术方法包括：基因克隆与蛋白表达纯化、酶动力学分析、X射线晶体学结构解析、停流CO₂水合测定法、细菌生长曲线监测以及细胞代谢活性检测（MTT法）。

2.1. LreCAγ的获得与功能分析

研究人员通过重组技术成功获得高纯度LreCAγ蛋白，酶活性测定证实其具有催化CO₂水合的能力。动力学分析显示，LreCAγ的催化效率（k_cat/K_M为1.6×10⁶ M^-1·s^-1）与其它细菌γ-CA相当，但低于高效的人源hCA II。值得注意的是，LreCAγ对临床常用抑制剂乙酰唑胺（AAZ）的敏感性（K_I=64 nM）高于比较对象霍乱弧菌γ-CA（VchCAγ，K_I=473 nM），这为选择性调控提供了可能。

2.2. LreCAγ的抑制研究

通过对多种阴离子和磺胺类化合物的抑制筛选，研究发现LreCAγ与VchCAγ以及人源CA同工酶之间存在明显的抑制选择性差异。例如，磺胺衍生物1和17对LreCAγ表现出显著的选择性抑制。这种抑制谱的差异为设计特异性靶向益生菌或病原菌CA的调控剂提供了重要线索。

2.3. LreCAγ的激活研究

最令人瞩目的发现来自激活剂筛选。在测试的胺类和氨基酸中，组氨酸的两种对映体（25和26）被鉴定为最有效的LreCAγ激活剂（K_A分别为8.3和9.7 μM）。立体化学对激活效果影响较小，但L-苯丙氨酸（27）的活性是D-对映体（28）的两倍。这些激活剂对不同CA同工酶的选择性激活特征，为开发特异性增强益生菌功能的策略奠定了基础。

2.4. LreCAγ的结构洞察

高分辨率晶体结构（1.26 ?）揭示LreCAγ形成三聚体，每个活性中心位于单体界面处，锌离子由三个组氨酸残基配位。与原型γ-CA（Cam）相比，LreCAγ在活性中心残基组成和环区结构上存在显著差异，特别是负责质子穿梭的谷氨酸在LreCAγ中被精氨酸取代。这些结构特征解释了LreCAγ独特的催化性质和调控特性。

2.5. 选定CA激活剂对大肠杆菌生长的影响

在大肠杆菌模型中，研究人员评估了CA激活剂对细菌生长的调控作用。有趣的是，L-酪氨酸（33）、L-对氨基苯丙氨酸（35）和血清素（38）能促进细菌生长，而当这些激活剂与AAZ合用时，其促生长效应被逆转。这一结果表明，这些化合物对细菌生长的调控确实是通过CA依赖的机制实现的。

2.6. 选定CA激活剂对人巨噬细胞和人肠上皮细胞的影响

在细胞水平上，L-色氨酸（31）和D-色氨酸（32）能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞活化，且L-色氨酸在肠上皮细胞中表现出良好的生物相容性。这一发现为将这些CA激活剂应用于调节肠道免疫反应提供了实验依据。

这项研究首次全面表征了益生菌L. reuteri的γ-碳酸酐酶LreCAγ，揭示了其独特的结构和功能特性。研究发现的不同CA同工酶在抑制和激活谱上的差异性，为设计选择性调控策略提供了重要依据。特别值得注意的是，某些氨基酸类激活剂不仅能增强CA活性，还能调节细菌生长和免疫反应，且对宿主细胞表现出良好的生物相容性。这些发现为开发通过特异性激活益生菌CA来增强其功能的新策略奠定了坚实基础，对维护肠道微生态平衡、预防和治疗菌群失调相关疾病具有重要意义。然而，研究者也谨慎指出，目前关于CA激活剂对益生菌生长的直接效应仍主要基于大肠杆菌模型，后续需要在L. reuteri本身进行直接验证，才能最终确认这一策略在益生菌应用中的实际价值。