冻融过程中蛋白质聚集机制解析：冷变性效应与剪切应力的关键作用

《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》：Deciphering protein aggregation in freeze-thaw process: the roles of cold denaturation and shear stress

本综述深入探讨了冻融循环中单克隆抗体聚集的关键机制，提出"应力时间"(stress-time)概念作为生物制药稳定性评估的核心指标。研究通过计算流体动力学(CFD)模拟与实验验证，揭示了冷变性温度区间(-5°C至Tg')和冰晶界面剪切应力对蛋白质聚集的协同影响，为生物制剂冻融工艺优化提供了创新性解决方案。

　　

Highlight

材料与方法

本研究使用一种勃林格殷格翰专有的免疫球蛋白G(IgG) 1单克隆抗体(mAb)。该单抗通过中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系生产，经过典型的三柱纯化工艺，浓缩并置换到制剂缓冲液中。实验选用65 mg/mL的mAb浓度，制剂缓冲液包含24.2 mM组氨酸、44 mM甘露醇、184 mM蔗糖和0.163 mM聚山梨酯20。所有辅料均达到注射级药用标准。

通过局部时间-温度曲线估算0.5升瓶中的应力时间分布

0.5升瓶中的应力时间分布通过CFD模拟确定，计算了从冰晶进入每个控制单元（冷冻平衡温度T_f）到达到冻融浓缩物玻璃化转变温度(T_g')所经历的时间。图3所示的模拟图谱展示了容器内应力时间的空间分布，清晰呈现了冻融过程中高应力时间累积的区域特征。

结论

本研究深化了对冻融循环中蛋白质聚集机制的理解。通过建立0.5升瓶的应力时间分布曲线，并在10 mL小瓶中通过精确控制冷却/加热速率实现对应重现，成功构建了适用于大体积样品的缩比模型。特别发现：在低冷变性区间(-5°C至T_f)延长应力时间并未显著增加聚集，而由冰晶界面渗透产生的剪切应力是引发聚集的关键因素。采用自下而上的冷冻几何设计可有效降低聚集水平，这为生物制剂冻融工艺优化提供了重要理论依据。