综述：利用高通量测序技术研究心血管疾病中外泌体非编码RNA的概述

《European Journal of Pharmacology》：Overview of Exosomal Non-coding RNAs in Cardiovascular Disease Using High Throughput Sequencing

本综述系统阐述了外泌体非编码RNA（ncRNA）在心血管疾病（CVD）中的关键作用，重点介绍了利用新一代测序（NGS）技术发现的三种主要ncRNA（miRNA、lncRNA、circRNA）作为生物标志物和治疗靶点的潜力。文章深入探讨了ncRNA在肾素-血管紧张素系统（RAAS）等关键通路中的调控机制，及其在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化等疾病中的临床应用前景与挑战，为CVD的精准诊疗提供了新视角。

　　

引言

心血管疾病（CVD）是全球范围内导致死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率居高不下。随着现代生活方式的变化，如压力、不健康饮食和年轻人群吸烟率上升，开发基于先进分子技术的创新策略对于改善心脏疾病治疗和慢性高血压患者预后至关重要。人类基因组中编码区域不足2%，这支持了非编码区域机制参与许多疾病的假说。非编码RNA（ncRNAs）作为转录调控的关键因子，在健康和疾病状态下发挥着重要作用，尤其是在细胞间通讯和表观遗传调控中。它们被包裹在外泌体、微泡和凋亡小体等细胞外囊泡（EVs）中，在体内运输并受到保护，从而在体液中稳定存在，这使其在诊断和治疗方面具有巨大潜力。

非编码RNA的分类与功能

根据长度，非编码RNA可分为小于200个核苷酸的小非编码RNA（sncRNAs，如miRNA）和大于200个核苷酸的长链非编码RNA（lncRNAs）。近年来，RNA测序技术的进步使lncRNAs受到广泛关注，其在染色质重塑、表观遗传调控和转录控制等多种生物学过程中扮演关键角色。根据基因组位置和相对于蛋白质编码基因的方向，lncRNAs可分为反义、正义、双向、内含子和基因间等多种类型，各自发挥不同的调控功能。它们在细胞核内通过调节染色质结构、转录激活或抑制等方式调控基因表达，在细胞质中则通过与蛋白质和其他RNA种类相互作用调节mRNA翻译。此外，lncRNAs可能作为miRNAs等小RNA的宿主转录本，两者常协同调控。

微小RNA（miRNAs）通过结合靶mRNA的3‘非翻译区（3’-UTR）互补序列，导致mRNA降解或翻译抑制，从而调控基因表达。miRNAs在发育、分化和癌症、CVD等疾病发病机制中不可或缺。其稳定性及在循环等体液中易于通过RT-PCR等方法检测的特点，使miRNAs成为主要疾病（尤其是癌症和CVD）的潜在非侵入性生物标志物。而微阵列和NGS等先进技术无需内参或预选探针即可对患者样本中的miRNAs进行定量、高分辨率分析，已成为疾病早期检测的金标准诊断工具。

环状RNA（circRNAs）是一类高度稳定的非编码RNA，其特点是形成共价闭合的连续环状结构，缺乏5‘和3’末端。这种环状结构使其能抵抗外切酶介导的降解，具有异常的分子稳定性。circRNAs通过充当“分子海绵”吸附miRNAs，阻止其与靶mRNAs相互作用，从而调控miRNA功能。通过设计针对其反向剪接接头的特异性引物，可以轻松检测circRNAs，这一结构特征增强了其在分子研究和诊断中的应用价值。

新一代测序用于非编码RNA生物标志物发现

在过去的二十年中，许多基因已成为潜在的生物标志物，并成为专门药物设计的研究对象。基因组学技术的近期进展，包括微阵列和NGS，引发了人们对lncRNA在正常细胞过程和疾病进展中作用的日益增长的兴趣。全基因组关联研究（GWAS）或靶向重测序在理解影响血压（BP）或高血压相关基因的遗传变异方面取得了显著进展。随着NGS的出现，已有文献记载大多数复杂的真核基因组被转录成ncRNAs，包括lncRNAs。NGS允许分析各种基因和基因表达系列分析（SAGE）变异，以识别外显子重复。此外，NGS提供了以高通量方式发现从罕见变异到常见变异、从单核苷酸变异（SNVs）到插入、缺失和拷贝数变异的全谱基因组改变的机会。

NGS技术是一个强大而稳健的工具，用于阐明高血压患者的特定遗传谱、分析失调的分子通路以及检测改变的生物机制和细胞生理学。各种ncRNAs，如Bvht和lincRNA-p21，通过RNA-seq技术被发现，它们在不同信号通路中扮演关键角色，并与众多生理过程和疾病相关。补充方法如染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）和交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）提供了更多关于ncRNAs如何与细胞内其他分子相互作用以发挥其效应的细节。这些方法通过绘制蛋白质-DNA/RNA相互作用以及染色质/RNA修饰位点来扩展我们的理解。

基因表达的改变为开发更精确有效的疾病治疗和诊断方法提供了见解。例如，小胶质细胞状态的变化及其相关的基因表达模式与各种神经系统疾病有关。此外，还建立了全外显子组测序（WES）项目，以寻找与心、肺和血液相关疾病相关的基因组中罕见的蛋白质编码变异（约2%）。外显子组测序已被用于确定与CVD相关的罕见变异，从而能够对表型明确的心血管队列进行诊断。下一个也是最完整的NGS方法是全基因组测序（WGS），用于测试罕见变异的影响。目前，利用NGS以较低成本对患有复杂疾病（如高血压）的患者进行WGS和WES以进行变异检测是可行的。

细胞外囊泡与非编码RNA作为心血管生物标志物

细胞外囊泡在心血管疾病中的生理作用

在心血管系统中，细胞外囊泡（EVs）在生理和病理状态下调节通讯。它们介导酶、受体和非编码RNA的释放，有助于血管重塑、内皮功能障碍、炎症和纤维化等过程。内皮细胞衍生的EVs在动脉粥样硬化中升高，既可作为损伤的标志物，也可作为疾病进展的积极参与者。EVs的大小也影响生物分布和治疗效率，较小的囊泡通过内吞作用显示出更大的摄取，而较大的聚集体则易于降解。心肌细胞衍生的EVs（CMEVs）在缺血性心脏病中尤其相关。在缺氧条件下，它们释放改变的货物，包括热休克蛋白60和促纤维化基质蛋白，这些货物可能加剧损伤，但也传递适应性信号。

非编码RNA在肾素-血管紧张素系统中的临床前和临床相关性

非编码RNA（ncRNAs）表现出与疾病（如高血压）病理生理学相关的独特表达模式，使其成为有前景的治疗靶点。许多研究调查了lncRNAs在CVD发病机制中的作用。最近，研究越来越多地关注ncRNAs在调节关键RAAS相关基因中的直接作用。其中，血管紧张素转换酶（ACE）是RAAS的关键组成部分，在血压调节中起基础性作用。因此，已经开发了许多针对ACE的制药抑制剂来治疗高血压相关病理。

一些研究检查了lncRNAs与ACE之间的关系。例如，miR-145调节血管平滑肌细胞（VSMCs）的分化和血管重塑。MiR-145、miR-483-3p、miR-27a和miR-27b通过降低ACE表达、调节VSMCs增殖和心血管重塑来调节高血压中的ACE/Ang-II/AT₁R信号通路。ACE被确定为miR-145的直接靶标，在VSMCs中miR-143/145的缺失导致ACE上调。使用卡托普利对ACE进行药理学抑制有效正常了与miR-143/145缺失相关的某些分子改变。

血管紧张素转换酶2（ACE2）是RAAS中受关键调控的酶，对心血管功能和高血压具有重要影响。在大脑中，ACE2通过交感神经调节调节血压，最近的研究强调了ACE2相关心血管研究的进展。鉴于ACE2的关键作用，表观遗传研究越来越关注ncRNAs对ACE2的影响，使其成为研究的优先事项。预测强调了几个睾丸特异性lncRNAs，以及miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-574-5p和miR-936作为ACE2的调节因子。在一项涉及280名参与者的临床研究中，观察到lncRNA-GAS5和miR-200表达水平之间存在显著的负相关，其中miR-200直接靶向ACE2，进一步强调了影响ACE2活性的复杂调控网络。

AT₁R和血管紧张素II 2型受体（AT₂R）是控制RAAS的重要受体，调节心血管功能和高血压中相反的生理效应。作为GPCR家族的成员，这些血管紧张素受体在血压调节中扮演关键角色。最近，Su等人表明，一个名为H19的lncRNA（上调）通过AT₁R通过沉默let-7b（同时刺激PDGF-BB产生）能够增加野百合碱诱导的肺动脉高压（PAH）小鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖。该lncRNA的敲除保护小鼠免受野百合碱刺激后的肺动脉重塑和PAH。

尽管使用工程化EVs治疗心力衰竭具有很高的潜力，但仍然存在许多技术和临床挑战，包括EVs的定量技术。这些技术包括动态光散射、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和电阻脉冲传感（RPS），在颗粒大小和准确区分sEVs与其他生理颗粒方面仍然存在局限性。因此，样品纯度检测的准确性较低。此外，通过超速离心等方法分离EVs可能会破坏样品运输过程，为此，最好使用其他方法如ELISA来量化EV标记蛋白的量。EVs的生物相容性和免疫原性对于临床应用非常重要，异源来源的EVs可以刺激免疫反应。EVs的储存条件、其稳定性以及EVs的靶向和递送效率是治疗心力衰竭的其他关键挑战和限制。

特定非编码RNA与心力衰竭、动脉粥样硬化和高血压

心力衰竭

LncRNA H19最初在某些肿瘤中被鉴定为癌基因。随后的研究表明，H19在CVD（如心力衰竭）中也发挥着重要作用。Yu等人表明，通过TGF-β信号通路和靶向let-7g，下调H19表达可通过抑制内皮间质转化来改善缺氧性肺动脉高压（HPH）大鼠的肺血管重塑和右心衰竭。Li等人研究了在存在丁酸钠的情况下，H19抑制与心力衰竭患者右心室肥厚改善之间的关系。他们表明，H19抑制恢复了let-7g-5p的水平，并阻止了肥厚心肌细胞中IGF1受体和pERK的过度表达。此外，H19表达的敲低通过靶向CDC42和PI3K/AKT信号通路加剧心肌损伤，导致心力衰竭大鼠心脏重塑受损。

MALAT1（转移相关肺腺癌转录本1）或NEAT2，在细胞和组织中含量丰富。该lncRNA参与调节转录和转录后过程中涉及的基因表达。最初，报告通常将该lncRNA的作用与癌症联系起来，然而，已发现MALAT1在CVD和高血压中也发挥作用。在这方面，Zeng等人表明，心力衰竭的原因之一是病毒性心肌炎。他们发现MALAT1通过UPF1增强了SIRT6 mRNA的富集，并干扰了SIRT6 mRNA的稳定性以促进病毒性心肌炎（VMC）的发展。MALAT1可以结合UPF1以介导SIRT6 mRNA衰变并激活VMC中的Wnt/β-catenin信号通路。

MicroRNA miR-21是一个重要的生物标志物，涉及许多生理和病理过程。它已被证明与关键调控基因相互作用，包括PTEN、TPM1和PDCD4。值得注意的是，miR-21是心血管稳态的介质，在心力衰竭患者中显著上调，并与BNP相互作用。最近的调查进一步确定，miR-21-3p通过其与CPT1A的相互作用，以及miR-21-5p通过其与ITGAV的关联，与心力衰竭的病理生理学直接相关。

MiR-208a由心脏肌球蛋白重链基因α和β编码，主要在心肌中特异性表达。研究表明，miR-208a与CVD（尤其是心力衰竭）的发生和进展至关重要相关。因此，该miR被认为是预防心力衰竭的潜在靶点。Gladka等人发现，在心力衰竭患者中，锌指E盒结合同源框2（ZEB2）蛋白的功能受miR-208a控制。因此，随着ZEB2表达的降低，会发生心肌细胞肥厚。Montgomery等人表明，抑制miR-208a导致Myh7表达降低、心脏细胞重塑减少以及Dahl高血压大鼠心力衰竭中心肌球蛋白转换的逆转。

MiR-150是CVD中的关键调节因子，特别是在心力衰竭的发病机制中。其调节与心脏重塑和心肌功能障碍密切相关。已经证明，miR-150在心力衰竭小鼠模型的β-肾上腺素能刺激诱导的心脏重塑中扮演关键角色。Wegiel等人报告称，miR-150-3p减轻心肌重塑并在心力衰竭中发挥保护作用。类似地，Moukette等人观察到，心力衰竭患者心肌细胞中的miR-150表达通过β- arrestin介导的β1AR信号传导上调，有助于心肌梗死后的病理性重塑。Aonuma等人进一步强调了miR-150在靶向HOXA4基因中的作用，指出卡维地洛降低了人和小鼠心脏成纤维细胞中HOXA4的表达。此外，他们确定miR-150是心力衰竭小鼠模型中心脏细胞功能的调节因子，其中它靶向Sprr1a。在这种情况下Sprr1a的下调被显示可以预防心肌梗死后的重塑。

动脉粥样硬化

LIPCAR（长基因间非蛋白质编码RNA，心脏重塑调节因子）已被确定为与CVD（包括动脉粥样硬化）相关的生物标志物，通过其参与线粒体功能障碍、氧化应激和血管炎症。虽然其最初的认识主要与心脏重塑和心力衰竭有关，但LIPCAR在CVD患者中升高，包括那些患有晚期动脉粥样硬化斑块的患者。因此，它已被提议作为风险分层和易发生动脉粥样硬化相关并发症个体早期识别的生物标志物。

INK4基因座中的反义非编码RNA（ANRIL），也称为CDKN2B-AS1，是一种与多梳抑制复合物（PRC1和PRC2）相互作用的lncRNA，以介导组蛋白修饰，从而上调促炎细胞因子并增强动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞介导的炎症反应。已经表明，ANRIL表达的失调可导致VSMC增殖增加，有助于斑块形成和不稳定性。此外，ANRIL通过诱导氧化应激和减少一氧化氮（NO）可用性来损害内皮功能。

母系表达基因3（MEG3）是一种lncRNA，通过下调抗氧化通路负向调节内皮细胞增殖并促进氧化应激和凋亡。据报道，血液或血管组织中MEG3水平的失调与动脉粥样硬化相关，并可能作为早期疾病检测的生物标志物。

MiR-143/145基因簇在动脉硬化中起关键作用；这是一种通常与高血压或糖尿病相关的疾病，导致血管壁增厚和管腔狭窄。在miR-143/145缺陷小鼠中，升高的ACE水平有助于血管紧张素（Ang）II驱动的血管张力失调和新内膜病变的发展，这是动脉硬化的标志。因此，靶向miR-143/145-ACE轴已被提议作为CVD（包括动脉硬化）的治疗方法。Kontaraki等人证明，在60名原发性高血压患者中，miR-143、miR-145和miR-133的表达水平降低，而miR-21和miR-1的表达水平升高。他们的发现表明，VSMC调节微RNA与人类高血压密切相关，并可能作为治疗高血压和动脉硬化的潜在治疗靶点。

Hall及其同事研究了一个位于miR-143基因附近的单核苷酸多态性（SNP）rs41291957，它上调了miR-143和miR-145，促进了VSMCs中的分化表型。该SNP似乎是通过影响miR-143/145的表达水平来对抗冠状动脉疾病（CAD）的保护性遗传因子。此外，发现miR-143/145通过EVs从平滑肌细胞转移到内皮细胞。这些微RNA靶向转化生长因子-β（TGFβ）并通过下调内皮细胞中的靶基因来控制血管稳态。此外，Elia等人证明，小鼠中miR-143和miR-145的缺失导致血管结构和功能的显著异常，强调了它们在血管健康中的重要性。最后，Quintavalle等人证实，miR-143/145簇的失调可导致血管病理，如动脉粥样硬化和高血压。

MiR-33（miR-33a和miR-33b）调节胆固醇和脂质代谢，并通过调节脂质稳态、胆固醇运输和巨噬细胞功能在动脉粥样硬化进展中起关键作用。MiR-33靶向ABCA1和ABCG1，这些对于将胆固醇从巨噬细胞输出到高密度脂蛋白（HDL）至关重要。此外，miR-33通过靶向基因（如CPT1A）调节脂肪酸氧化和脂质代谢。MiR-33影响巨噬细胞极化，促进促炎表型（M1），同时抑制抗炎巨噬细胞（M2）。这种转变加剧了动脉粥样硬化斑块内的炎症。MiR-33降低了参与斑块稳定性的基因（如COL1A1和COL3A1）的表达，可能增加斑块破裂的风险。因此，基于反义miR-33寡核苷酸的疗法正在作为动脉粥样硬化的潜在干预措施进行研究。

MiR-126的下调与动脉粥样硬化的发生和进展密切相关。MiR-126促进内皮再生和血管生成，有助于血管健康。已经表明，miR-126靶向VCAM-1，减少炎症细胞向内皮细胞的募集。Gao等人证明，动脉粥样硬化患者中miR-126水平降低，使其成为早期检测和疾病进展监测的潜在生物标志物。最后，miR-155通过增加炎症期间的巨噬细胞活性在动脉粥样硬化斑块进展中起关键作用。已经表明，miR-155通过靶向SOCS1增强肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的产生。几项研究表明，miR-155在动脉粥样硬化中扮演复杂角色，影响炎症、脂质代谢和斑块稳定性，使其成为治疗干预的有吸引力的靶点以及动脉粥样硬化和高血压的潜在生物标志物。

高血压

高血压，或血压升高，是CVD的主要风险因素。表观遗传研究强调了ncRNAs在调节与高血压相关的基因表达中的关键作用，这些基因表达影响高血压背后的关键病理生理过程，包括血管重塑、炎症和RAAS的调节。特定lncRNAs的表达与高血压直接相关，包括ANRIL、GAS5、HIF-α、H19、lncAng362、MIAT、LIPCAR和MALAT1。一些lncRNAs，如ANRIL、H19、LIPCAR和Lnc-Ang362，在多种CVD中表现出共同的表达模式，表明它们参与共享的病理机制。相反，像GAS5、NEAT1和HOTAIR这样的lncRNAs更具体地与动脉高血压相关，突出了它们在血压调节中的潜在作用。

GAS5在成人组织和胚胎发育过程中广泛表达。GAS5的表达降低或敲低增强了内皮细胞活力和增殖，减少了凋亡，并导致异常的内皮激活。炎症细胞因子诱导的血管细胞表达RNA（Giver）已被鉴定为一种可以通过核受体NR4A3增加Ang II表达从而增加氧化应激的lncRNA。Giver还增加了VSMCs的增殖并控制炎症基因的表达。其在高血压患者中表达显著升高，用ACE抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂治疗显著降低了Giver水平。

AK098656在高血压患者中显著上调。由VSMCs产生，它促进VSMC增殖、迁移、细胞外基质产生和收缩蛋白降解。因此，AK098656可能参与阻力动脉的调节，促进VSMCs的合成表型，并可能作为临床诊断或治疗干预的新型生物标志物。

在PAH中，已显示Tug1调节肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖，从而有助于血管重塑，这是PAH的标志。长链非编码RNA Tug1（牛磺酸上调基因1）在高血压相关的血管和肾脏病理中起重要作用。报告显示，Tug1在自发性高血压大鼠（SHR）的主动脉中高表达，并促进VSMC增殖和迁移。从机制上讲，Tug1作为miR-145-5p的分子海绵，后者抑制成纤维细胞生长因子10（FGF10）表达，从而将Tug1/miR-145-5p/FGF10轴定义为高血压中VSMC功能障碍的关键调节因子。此外，Tug1通过海绵吸附miR-141-3p来增强VSMC增殖、迁移、侵袭和转移，后者靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（ROR2）。这个Tug1/miR-141-3p/ROR2轴进一步强调了其在加速VSMC进展中的作用。Tug1还作为miR-29b-3p的竞争性内源RNA（ceRNA），后者通过RAAS抑制肾脏中的上皮-间质转化（EMT）和细胞外基质产生。此外，在Ang II或醛固酮刺激下，盐皮质激素受体直接与Tug1相互作用并诱导其表达。在纤维化的人肾活检样本中观察到Tug1的上调，表明它是Ang II诱导的肾纤维化的关键介质。此外，Tug1敲低增加了miR-9-5p水平，后者抑制CXCR4表达并减轻Ang II诱导的内皮损伤。这些保护作用在miR-9-5p沉默或CXCR4过表达时被逆转，确立了Tug1/miR-9-5p/CXCR4轴作为内皮功能障碍的关键调节因子和CVD及高血压的有前景的治疗靶点。

对小鼠模型的分析显示，外泌体miRNAs，包括miR-425-5p和miR-128-3p，在SHR中的水平比Wistar Kyoto大鼠（WKY）高约三倍。此外，在高血压患者中，miR-128-3p miRNAs抑制mRNA翻译并对这些生物分子施加负调控作用。miR-128-3p还通过Kruppel样因子4（KLF4）调节包括增殖、血管平滑肌细胞收缩和VSMC肌球蛋白重链11（Myh11）基因甲基化在内的细胞活动。Yin等人记载，miR-128通过抑制c-Met表达促进凋亡并对高血压患者的心脏细胞造成损伤。Farina等人证明，miR-128靶向Kruppel样因子4（Klf4），后者甲基化肌球蛋白重链11（Myh11），从而在颈动脉再狭窄小鼠模型中预防内膜增生，而不改变关键心血管参数。

在原发性高血压患者中，升高的miR-21表达降低了内皮一氧化氮合酶（eNOS）水平，从而启动了动脉粥样硬化过程。Li等人报告，由线粒体基因组编码的细胞色素b（mt-Cytb）诱导的miR-21表达增加升高了人类的血压。这种增加的miR-21表达增强了高血压小鼠模型中的活性氧生成。高血压的一个重要并发症是肾脏损伤，已发现这会影响高血压伴蛋白尿患者外泌体中29种miRNAs的表达谱。其中，miR-26a通过TGF-β信号传导促进足细胞损伤，并可能作为早期肾损伤的诊断生物标志物。Solayman等人证明，miR-19a、miR-101和let-7e通过调节β1-肾上腺素能受体和参与β阻滞剂药效学的其他基因发挥β阻滞作用，从而影响血压调节。

新一代测序在心血管研究中的应用

新一代测序（NGS）技术极大地提高了我们探索心血管疾病（CVD）和高血压转录组的能力，包括lncRNAs、miRNAs和circRNAs。这些方法提供了对基因调控、细胞类型特异性以及复杂信号通路（如RAAS）的高分辨率见解。尽管有这些进步，一些技术和应用相关的挑战仍然存在。

一个关键限制是lncRNAs的检测，它们通常表达水平低，在循环中稳定性差，并显示组织或细胞特异性表达。虽然像NONCODE这样的数据库编录了数万个lncRNAs，但它们在高血压中的生物学作用仍然 largely 不清楚。单细胞测序（SCS）提高了研究细胞异质性的分辨率，但其与疾病特异性转录组数据的整合仍处于起步阶段。

对于miRNA研究，像小RNA测序这样的NGS方法提供了高灵敏度和动态范围，允许量化细微的表达变化和发现新的变异。然而，测序偏差、需要广泛验证（例如通过qPCR）以及数据复杂性对临床转化构成了障碍。罕见miRNA变异的检测以及miRNA-mRNA相互作用的解释在技术上仍然要求很高，需要强大的生物信息学流程。

CircRNA研究受益于NGS，因为它能够捕获传统方法经常遗漏的低丰度环状异构体。然而，挑战包括将circRNAs与线性异构体区分开来、低表达水平以及功能注释的困难。这些限制阻碍了将circRNA发现转化为CVD中可靠的生物标志物或治疗工具。另一个主要挑战是测序数据的量和复杂性。NGS产生海量数据集，需要简化的流程进行数据提取、标准化和分析。技术伪影、低信噪比和变异注释的困难常常使解释复杂化。此外，实验室之间的标准化有限，这限制了可重复性和跨研究比较。

超越单个RNA种类，整合多组学方法（转录组学、表观基因组学和蛋白质组学）对于全面的生物标志物发现是必要的。然而，协调不同的数据集在计算上仍然密集且在统计上具有挑战性