肉桂醛Pickering乳液靶向抑制腐败菌生物被膜：特性表征、体内外效应及转录组学机制解析

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Effect of cinnamaldehyde pickering emulsion on Pseudomonas fragi biofilms: Characterization, antibiofilm effects in vitro and in vivo, and a transcriptomic analysis

本研究针对生鲜冷鲜肉中腐败菌Pseudomonas fragi生物被膜污染控制难题，开发了基于乳清蛋白稳定的肉桂醛Pickering乳液体系。通过分子对接优化配方，表征显示乳液具备优异稳定性（粒径11.30±1.88μm，ζ电位-31.6mV）和缓释特性，动物实验证实其生物安全性。研究发现该乳液在保持MIC（0.3125mg/mL）不变前提下，显著增强对生物被膜的抑制/清除效果，转录组学首次揭示其通过调控191个差异基因（114个下调/77个上调），同时抑制信号转导（TCS）与代谢通路并诱导应激响应，为绿色防腐技术开发提供理论依据。

　　

在城市化进程加速和生活方式变革的背景下，生鲜冷鲜肉已成为满足城市饮食需求的重要解决方案。然而，微生物污染导致的肉质变质事件占比超过25%，其中Pseudomonas fragi（P. fragi）被确定为冷藏肉制品贮藏系统中的主要腐败菌。这种细菌具有卓越的生物被膜形成能力，是导致肉类持续污染的关键因素。尽管研究表明该菌形成的生物被膜通过增强抗菌药物抗性和水平基因转移等机制对肉类安全和质量构成重大风险，但针对其生物被膜的研究仍处于探索阶段。全球每年肉类腐败超过1000万公吨，导致食品供应链重大经济损失并加剧食品安全隐患。现有干预策略主要基于物理/化学方法，对已形成生物被膜的抑制效果有限，且可能影响产品安全性。因此，开发针对生鲜冷鲜肉中主要腐败菌生物被膜的新型防腐剂具有重要实践意义。

植物精油（EOs）展现出显著抗菌活性和生物安全性，其中肉桂醛（CA）作为肉桂精油的主要生物活性成分，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）等监管机构批准用于食品应用。大量研究证实CA对某些病原菌生物被膜具有抑制功效，但其存在挥发性强、水溶性差等固有局限性，且有效抗菌浓度常超过感官接受阈值。近年来，研究人员通过将CA制备成Pickering乳液（与传统表面活性剂稳定乳液相比具有增强的物理稳定性和良好的负载/释放特性）有效解决这些问题，从而最大化其生物活性。乳清蛋白分离物（WPI）可作为Pickering乳液的稳定剂，其蛋白分子上的游离氨基可通过希夫碱反应与CA的游离羧基结合，发挥优异抗菌效果。为促进CA Pickering乳液在肉制品生物被膜控制中的更好应用，阐明其抑制机制至关重要。然而，特异性研究CA生物被膜抑制机制的报道有限，且CA Pickering乳液对微生物生物被膜的抑制机制尚未见报道。

转录组学凭借高通量检测和处理海量数据的优势，成为生物被膜形成机制研究的有力工具。近期研究采用该方法阐明精油抑制生物被膜的机制，例如转录组分析显示丁香和牛至精油亚最小抑菌浓度（Sub-MIC）可显著降低Salmonella Derby生物被膜中能量代谢相关基因表达，而丁香酚则降低Staphylococcus aureus生物被膜中胞外聚合物（EPS）、转录因子和群体感应（QS）相关基因表达。因此，转录组学可用于初步探究CA Pickering乳液对P. fragi生物被膜的抑制作用。

本研究选择十种精油成分中对目标菌株抑菌活性最强（MIC=0.3125mg/mL）的CA作为活性成分。首先通过分子对接模拟和仪器表征系统研究CA负载Pickering乳液的稳定性、安全性和缓释行为；随后通过结晶紫染色和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定量评估其对目标菌株的抗生物被膜功效；体内（鲜肉表面）和体外实验证实乳液具有强效生物被膜清除能力；最后通过转录组学阐明乳液的抑制机制，包括抑制双组分信号（TCS）转导系统、破坏中心代谢途径和削弱细菌应激适应反应。该研究成果为精油成分稳定化策略提供新见解，并为CA Pickering乳液在食源性腐败微生物生物被膜防控中的应用提供理论基础。

关键技术方法包括：通过分子对接模拟分析WPI、CA和亚油酸（LA）相互作用；采用荧光光谱和圆二色谱（CD）表征蛋白质构象变化；通过测定乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）优化油水比；利用激光粒度分析仪和纳米粒度分析仪测定乳液粒径和ζ电位；采用流变仪分析乳液流变特性；通过测定过氧化值（POV）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）评估氧化稳定性；使用透析袋法研究CA释放特性；通过小鼠急性经口毒性试验和溶血试验进行安全性评价；采用96孔板二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）；通过结晶紫染色法和菌落计数法评估生物被膜抑制和清除效果；利用CLSM观察生物被膜结构；基于RNA-Seq技术进行转录组学分析，通过GO和KEGG富集分析差异表达基因功能。

3.1. MIC of essential oil components

研究筛选十种植物源抗菌化合物，发现CA对P. fragi的抑菌活性最强（MIC=0.3125mg/mL），因此选择CA作为后续研究的活性成分，并采用亚MIC浓度进行生物被膜抑制机制研究。

3.2. Molecular docking

分子对接显示WPI与CA、LA的结合能为-8.424kcal/mol，表明强亲和力。复合物主要通过疏水相互作用、氢键和π-π堆积稳定，为高性能Pickering乳液构建提供理论基础。

3.3. Spectroscopic characterization of conformational changes

荧光光谱显示WPI-CA和WPI-CA-SSO复合物发生荧光猝灭和蓝移，表明CA结合使三级结构更紧凑。CD光谱显示复合物形成导致二级结构显著变化，α-螺旋和β-折叠含量增加，随机卷曲减少，表明CA和SSO协同促进更有序稳定的二级结构。

3.4. Determination of optimal oil-to-water ratio for CA Pickering emulsions

在油水比6:4（v/v）时乳液呈现最佳EAI和ESI值。CLSM和OM显示该比例乳液液滴尺寸最小、分布最窄，且具备卓越储存稳定性和离心稳定性。

3.5. Characterization of CA Pickering emulsion

接触角测定（72.1°）证实乳液为O/W型。最优配方乳液平均粒径11.30±1.88μm，ζ电位-31.6±0.82mV。流变学表征显示乳液具有剪切稀化行为和显著弹性响应。氧化稳定性测试表明乳液能有效抑制脂质氧化。释放特性显示乳液具备快速初始释放和持续缓释的双相释放模式。安全性评价证实乳液在应用浓度下无急性毒性和溶血活性。

3.6. Effect of CA of sub-MIC on biofilm formation

CA Pickering乳液MIC与CA溶液相同（0.3125mg/mL），但在亚MIC浓度下表现出显著增强的生物被膜抑制和清除效果。在4°C条件下，1/2 MIC乳液对早期生物被膜的抑制率（48.91%）是溶液（18.98%）的2.6倍，且乳液在不同温度下性能稳定。

3.7. Microscopic observation of biofilm

CLSM观察显示CA处理显著降低生物被膜密度，且乳液效果优于溶液，证实CA是P. fragi的有效抑制剂。

3.8. Transcriptomic analysis

转录组分析发现CA乳液处理导致191个差异表达基因（DEGs），其中114个下调、77个上调。GO富集分析显示下调基因主要富集于铁离子转运等过程，上调基因主要富集于细胞色素c氧化酶活性等氧化还原酶活性。KEGG分析表明下调DEGs主要富集于叶酸生物合成、双组分系统（TCS）和氨基酸代谢通路，上调DEGs主要富集于氧化磷酸化、脂肪酸降解等代谢通路和应激响应通路。表明CA乳液通过多靶点干扰机制抑制生物被膜形成。

研究结论表明，CA负载Pickering乳液具备良好的物理稳定性、控释特性和生物安全性，对P. fragi生物被膜形成具有显著抑制/清除作用。转录组分析揭示了其通过代谢干扰、信号转导抑制和应激响应调控的多靶点干扰机制。该研究为冷鲜肉保鲜提供了潜在解决方案，并为下一代生物被膜控制策略的开发奠定了机制基础。未来研究将结合蛋白质组学和代谢组学动态监测关键调控节点的时序表达变化，并通过基因敲除技术验证核心靶点的功能贡献。