脉冲电场增强固定化脂肪酶和甘露聚糖酶催化性能的创新研究

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Boosting catalytic performance of two immobilized enzymes via pulsed electric fields (PEF)

本研究针对工业生物催化剂稳定性差、成本高的问题，探索了脉冲电场(PEF)技术对共价固定于生物基复合泡沫载体上的Candida rugosa脂肪酶(CRL)和Trichoderma reesei甘露聚糖酶(TRM)的激活效应。结果表明，在优化参数下(3 kV/cm, 10 μs, 1 Hz)，PEF可使CRL和TRM活性分别提升53.11%和63.26%，并能将使用10次后活性下降20%的酶体系重新激活至初始活性100%以上。该技术为工业生物催化过程的效率提升和成本控制提供了新策略。

　　

在当今追求绿色可持续发展的工业背景下，酶作为高效、专一且环境友好的生物催化剂，在化工、食品、医药等众多领域扮演着越来越重要的角色。然而，酶的“娇气”是出了名的——它们在游离状态下往往不稳定，容易失活，且难以回收重复使用，这直接推高了生产成本，限制了其大规模工业应用。为了解决这一难题，科学家们开发了酶固定化技术，即通过物理或化学方法将酶“拴”在固体载体上，如同给酶安了一个家，从而显著提高其稳定性和可重复使用性。但即便如此，固定化酶在长期使用后仍难免活性衰减，寻找一种能够有效“唤醒”或增强固定化酶活性的方法，一直是生物催化领域的研究热点。

与此同时，一种名为脉冲电场(Pulsed Electric Field, PEF)的非热加工技术逐渐进入研究者的视野。PEF技术最初应用于食品保鲜和灭菌，它通过施加短暂的高强度电脉冲来处理物料。有趣的是，研究人员发现，PEF对酶的作用并非总是抑制性的。早在上世纪90年代，就有学者报道PEF处理能提高胃蛋白酶的活性。此后，陆续有研究表明，适当的PEF条件可以激活诸如β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶等多种酶。然而，这些研究大多针对溶液中的游离酶，并且PEF激活酶的确切机制至今仍不明确，如同一团迷雾。更关键的是，PEF技术能否应用于已经固定化的酶系统，从而为工业生物催化剂提供一种全新的“性能增强器”，此前尚属空白。

发表在《Innovative Food Science 》上的这项研究，正是为了填补这一空白。由Juan David Galvis-Nieto等人领导的研究团队，首次系统性地探索了PEF对两种已固定于生物基复合泡沫载体上的工业重要酶——Candida rugosa脂肪酶(CRL)和Trichoderma reesei甘露聚糖酶(TRM)的活性、操作稳定性及储存稳定性的影响。他们致力于回答几个核心问题：PEF能否激活固定化酶？最佳的PEF处理参数是什么？这种激活效果能持续多久？能否利用PEF让因重复使用而活性下降的固定化酶“焕发新生”？

为了回答这些问题，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们通过共价结合法，将CRL和TRM固定于一种由环氧树脂和稻壳纤维制成的生物基复合泡沫(Bio-based composite foam, BF)载体上，构建了稳定的固定化酶系统(Immobilized Enzyme System, IES)。其次，他们利用一套可精确控制参数的PEF处理系统（EPULSUS-PM-10脉冲发生器），对IES进行了一系列处理，系统考察了电场强度(2-5 kV/cm)、脉冲数量（对应特定能量输入，2.4-12.6 kJ/kg）、脉冲宽度(2-70 μs)和脉冲频率(1 Hz vs. 10 Hz)对酶活性的影响。酶活性的检测则分别采用分光光度法（CRL，基于对硝基苯酚释放）和DNS法（TRM，基于还原糖生成）。此外，还系统评估了IES在10次重复使用后的操作稳定性，以及PEF处理后在常温避光储存三周内的储存稳定性。

3.1. 操作稳定性

未经PEF处理的固定化脂肪酶(CRL-IES)和甘露聚糖酶(TRM-IES)在重复使用10次后，活性分别平均下降了约20%和17%，表明该固定化系统本身具有良好的操作稳定性，为后续PEF激活效果的研究提供了可靠的基础。

3.2. 电场强度效应

研究发现，电场强度对酶活性影响显著且存在一个“甜蜜点”。对于CRL-IES，在3 kV/cm的电场强度下，活性显著提升了53.11%；而当强度升高至4 kV/cm或5 kV/cm时，活性反而下降。TRM-IES则在4 kV/cm时表现出55.69%的活性提升。这表明较低的电场强度（3-4 kV/cm）是激活这两种固定化酶的关键，而过高的强度会导致抑制甚至失活。

3.3. 特定能量效应

通过改变脉冲数量来控制输入样品的特定能量，研究揭示了能量输入的“剂量依赖性”。对于CRL-IES，在3 kV/cm下，28个脉冲（对应能量4.48 kJ/kg）能实现最佳激活（活性提升53.11%）；脉冲数过少或过多（能量过低或过高）则激活效果不显著甚至导致活性降低。TRM-IES在3 kV/cm下，30个脉冲（6.30 kJ/kg）时活性提升最大（63.26%）。这表明存在一个最优的能量窗口，超出此窗口，激活效应会减弱。

3.4. 脉冲宽度效应

脉冲宽度的影响因酶而异，体现了酶的特异性。CRL-IES仅在10 μs脉冲宽度下表现出显著激活，而在2 μs和70 μs下则无显著效果。相比之下，TRM-IES在10 μs和60 μs脉冲宽度下均能被有效激活。这说明针对不同的酶，需要优化特定的脉冲宽度参数。

3.5. 频率

频率的影响同样关键。在1 Hz的低频率下，PEF处理对两种IES均产生了显著的激活效果；而当频率提高到10 Hz时，激活效果消失。这提示较低的脉冲重复频率更有利于PEF对固定化酶的激活作用。

3.6. PEF再激活

本研究的一个突出亮点是发现了PEF的“再激活”能力。当CRL-IES和TRM-IES在经过10次使用活性下降后，施加一次优化的PEF处理（CRL: 3 kV/cm, 10 μs, 28脉冲, 1 Hz；TRM: 3 kV/cm, 10 μs, 30脉冲, 1 Hz），酶的活性不仅得以恢复，甚至暂时超过了初始活性（超过100%）。尽管在后续的5次使用中活性再次下降，但这首次证明了PEF可用于恢复因重复使用而疲劳的固定化生物催化剂活性。

3.7. 储存稳定性

另一个令人惊奇的发现是PEF处理后的“储存增强效应”。经过PEF处理的IES在常温避光储存期间，活性出现了显著且暂时的飙升。CRL-IES的活性在一周后惊人地达到了初始活性的507%，并在三周内仍维持在393%的高位。TRM-IES的活性也在一周后升至207%，但随后回落至基线水平。这表明PEF处理可能诱导了酶构象或载体微环境的持续性变化，这种变化在储存期间逐渐显现并达到峰值。

在讨论部分，作者深入分析了可能的原因。他们指出，PEF的激活效应可能源于其对酶蛋白结构的微调，例如改变其二级和三级结构（如α-螺旋、β-折叠比例）、表面电荷分布、疏水核心的排布等，从而优化其活性构象。所使用的生物基复合泡沫载体可能通过其亲水-疏水平衡的微环境，以及其聚合物骨架与酶之间的静电相互作用，起到了稳定PEF诱导的有利构象的作用，这或许是本研究中观察到的激活效果比以往报道的游离酶激活效果更显著、更持久的原因之一。作者也承认，PEF激活酶的具体分子机制仍需进一步研究，例如通过圆二色谱(CD)、荧光光谱等技术分析结构变化。

综上所述，这项研究取得了多项创新性成果：首次证实PEF可有效激活已固定化的酶（CRL和TRM）；明确了针对这两种固定化酶的低强度、低能量PEF处理参数窗口；发现了PEF对使用后活性下降的固定化酶具有显著的再激活能力；观察到了PEF处理后固定化酶在储存期间独特的活性飙升现象。这些发现不仅为理解和应用PEF技术调控酶活性提供了新的视角和实验证据，更重要的是，为工业生物催化领域开辟了一条潜在的、非热式的、可循环的催化剂性能强化与再生新途径。尽管长期稳定性仍是挑战，但这项研究无疑为开发更高效、更经济、更可持续的工业生物过程奠定了坚实的基础，具有重要的科学意义和潜在的应用价值。