开发了一种新型的双链PCR-侧向流动免疫测定法（d-PCR-LFIA），用于同时检测亚洲 Liberibacter candidatus 和柑橘衰退病毒

《Tropical Plant Pathology》：Development of a novel duplex PCR-lateral flow immunoassay (d-PCR-LFIA) for simultaneous detection of Candidatus Liberibacter asiaticus and citrus tristeza virus

柑橘黄龙病和衰退病双PCR-侧流层析联检技术实现快速灵敏检测，无需电泳，特异性达100%，LOD分别为≤0.135pg（CTV）和40pg（CLas），适用于移动实验室田间即时诊断。

　　

摘要

柑橘产业面临着多种病原体的严重威胁，其中两种主要病原体——柑橘衰退病毒（CTV）和亚洲柑橘 Liberibacter 细菌（CLas）对果实品质、产量以及果园的寿命造成了严重影响。利用快速准确的检测方法对这些具有破坏性的病原体引起的疾病进行诊断对于早期疾病管理至关重要。目前有多种方法被常规用于检测 CTV 和 CLas，但大多数方法存在局限性，如操作繁琐、耗时较长，且灵敏度和特异性不足，这限制了它们在常规筛查和管理中的适用性。在本研究中，我们开发了一种双重聚合酶链反应结合侧向流动免疫测定（d-PCR-LFIA）的技术，能够快速同时检测 CTV 和 CLas 病原体。该技术消除了基于琼脂糖凝胶电泳的终点检测步骤，因此适用于现场检测。通过结合 PCR 的高特异性和 LFIA 的可视化简便性，该诊断工具具有高灵敏度和易于解读的优点。我们根据 CTV 的 p25 衣壳蛋白基因（CTRPA-F/R）和 CLas 的 16S rRNA 基因（DKG-F/R）的保守区域设计了特异性引物对，并对相关参数进行了系统测试和优化，以实现最佳的检测性能。CTV 的最低检测限（LOD）为 ≤0.135 pg，CLas 的最低检测限为 40 pg（cDNA/DNA）。经过标记的 d-PCR 扩增子稀释后，d-PCR-LFIA 的灵敏度可达到 1x10^-4 μL。通过使用 90 个已知阳性样本、田间样本和健康对照样本，验证了该方法的特异性和准确性。该检测方法未与其他柑橘病原体发生交叉反应，对 CTV 和 CLas 的特异性达到 100%。Cohen's Kappa 值为 0.977，表明这些诊断工具之间具有高度一致性，显示出极高的可靠性。该方法无需接触致癌化学物质，即可实现 CTV 和 CLas 的快速、肉眼可见的检测。d-PCR-LFIA 是疾病诊断领域的一项重大进展，有望成为同时检测这两种病原体的即时诊断工具，并可能在配备便携设备的移动实验室（“车载实验室”）中用于开展柑橘健康植株检测项目。