综述：通过先进递送系统用于体内靶向治疗的工程化RNA器件

《Aggregate》：Engineered RNA Devices for In Vivo Targeted Therapeutics via Advanced Delivery Systems

本综述系统阐述了工程化RNA器件（如toehold开关、miRNA分子开关、ADAR传感器等）与先进递送系统（如LNP、AAV、SORT LNP等）相结合，在精准医疗领域的最新进展。文章重点探讨了这些器件如何通过识别疾病特异性标志物（如miRNA、特定转录本）实现细胞水平精准基因调控，并分析了其在疾病诊断和治疗中的应用潜力、当前局限性及未来发展方向，为开发可编程生物平台提供了重要见解。

　　

工程化RNA器件：通过先进递送系统实现体内靶向治疗的新前沿

1 引言

精准医疗通过整合组学技术与先进医学方法，为疾病和个体患者制定个性化诊疗策略。RNA疗法（包括ASO、siRNA、miRNA、mRNA和RNA适配体）在医学领域展现出巨大优势，其发展因COVID-19 mRNA疫苗的成功而加速。然而，RNA固有的不稳定性及穿透靶细胞能力的限制，使其疗效和安全性高度依赖于专用递送系统。目前，RNA递送策略主要包括病毒载体（如腺病毒、AAV）和非病毒载体（如LNP、外泌体、LPNP）两大类。尽管病毒载体递送效率高，但其潜在的致癌性、免疫原性及高生产成本限制了其广泛应用。非病毒递送系统，特别是创新的SORT LNP、抗体偶联LNP及新型可电离脂质配制的LNP，显著提高了RNA向靶组织/器官的递送效率。合成生物学聚焦于重构生物系统以赋予其新功能，其应用范围从设计新型酶到开发细胞疗法。传统上，合成生物学主要基于DNA构建合成系统，但随着RNA疗法转化潜力的显现，利用RNA分子独特特性开发合成系统的兴趣日益增长。RNA器件是由RNA组成的工程化生物模块，作为分子传感器和调节器，能够识别特定输入信号（如小分子、蛋白质、转录本），并将其转化为精确定义的输出，通常控制转录、翻译或RNA稳定性。当组织成网络状结构时，RNA器件可产生能够执行更复杂功能的合成电路。因此，通过合成生物学方法设计的RNA器件可在细胞水平实现精准调控，广泛应用于创新诊断策略和治疗干预措施的开发。将RNA器件与先进递送技术相结合，有望增强基于RNA器件的疗法在精准疾病治疗中的功效。

2 Toehold开关

Toehold开关是一种巧妙设计的RNA开关。其将mRNA的5'末端折叠成发夹结构，将核糖体结合位点和起始密码子隐藏于发夹内。发夹基部有一个暴露的"toehold"序列，等待与特定的触发RNA配对。当触发RNA与toehold区域完美结合时，它会沿发夹解链，暴露隐藏的RBS和AUG，从而允许核糖体准确结合并启动蛋白质翻译。该概念由J.J. Collins团队于2014年首次提出，通过精心设计RNA序列，toehold开关可实现平均超过400倍的动态范围，并能整合到基因组系统和复杂遗传电路中。随后，研究人员将其应用于寨卡病毒毒株的区分检测，标志着toehold开关在疾病诊断中的首次应用。在真核细胞中，toehold开关被开发用于检测内源性和外源性表达的miRNA。近年来，研究人员建立了miRNA触发的toehold开关转录激活平台，通过流体力学方法将编码白喉毒素A片段和PDX-1的mCTA质粒系统递送至动物体内，在肿瘤和糖尿病小鼠模型中展示了时空可控的基因治疗效果。然而，toehold开关RNA在复杂的体内环境中易快速降解，且在非特异性RNA高浓度存在时仍可能发生脱靶效应。因此，需要机器学习优化其结构，并通过化学修饰核苷酸增强RNA稳定性。先进递送平台如LNP、AAV和水凝胶系统有望实现细胞水平的精准治疗。

3 内部核糖体进入位点介导的分子开关

内部核糖体进入位点是一种位于mRNA 5'端非编码区的特殊序列，可在特定反式作用因子协助下，直接招募小核糖体亚基与mRNA内部结合，实现非经典起始位点的翻译启动。IRES开关主要分为两类：一类是将toehold序列整合到IRES结构中以破坏其次级构象；另一类是通过筛选不同的IRES结构以匹配特定细胞的IFs和IRES ITAFs。有研究提出通过将两个互补序列整合到IRES中来破坏IRES-核糖体假结的方法。在含有触发物的细胞中，这些序列配对可恢复天然IRES结构，实现高达16倍效率的特异性基因调控。通过将结构被破坏的IRES序列与反义技术结合，可创建选择性表达的RNA分子，在胶质瘤模型中显著抑制疾病进展。此外，利用细胞特异性表达的ITAFs也可实现蛋白质的特异性表达。研究发现，部分腺癌高度表达EIF4G2和PTBP1，这恰好满足IV型IRES结构启动翻译的条件。因此，构建基于HRV-2 IRES的编码突变GSDMD蛋白的环状mRNA，并通过FDA批准的LNP递送，可在eIF4G2/PTBP1胰腺腺癌中实现RNA药物的精准基因调控，有效消除荷瘤小鼠的肿瘤负荷并间接赋予其抗肿瘤免疫力。然而，基于IRES的结构工程化以实现细胞特异性表达对合成生物学领域外的研究人员仍具挑战性，且许多IRES元件的二级结构尚未完全解析。

4 miRNA分子开关

miRNA是小的单链组织特异性非编码RNA分子，作为基因表达的关键转录后调节因子，通过调节mRNA稳定性和翻译来控制细胞过程。每种细胞类型都有独特的miRNA谱，使其成为普遍适用的细胞类型标记物。将miRNA结合位点整合到工程化RNA器件中，可有效利用miRNA的固有生物学特性减少其脱靶效应。首次使用miRNA分子开关-LNP进行体内疾病治疗的研究将miR122或miR142的完全互补miRNA靶位点整合到IVT mRNA的3'UTR中。miR122对健康肝细胞特异但在肝细胞癌中常被抑制，而miR142对造血谱系细胞特异。因此，3'UTR miR122靶位点可限制治疗性mRNA在健康肝细胞中的表达，但允许其在HCC细胞中表达，而3'UTR miR142靶位点可限制其在许多抗原呈递细胞中的表达。最终，在编码凋亡蛋白caspase或PUMA的治疗性mRNA中加入miRNA靶位点，可防止其在健康肝细胞中表达，同时触发肝癌细胞凋亡。为同时实现精确激活和抑制，研究人员开发了能够在"ON"和"OFF"状态之间切换的miRNA响应混合mRNA开关。OFF开关将miRNA结合位点置于5'UTR内，而ON开关则将靶miRNA结合位点设计在poly A尾下游，后跟一个辅助抑制序列。混合开关通过在5'和3'端均加入miRNA响应元件进一步增强调控精度。通过整合器官靶向LNP优化与mRNA工程化，研究人员开发了器官和细胞特异性的双特异性mRNA-LNP技术。基于SORT策略，他们开发了肺靶向sm-102 LNP，并发现减少LNP组分数量可显著提高mRNA递送效率。将142ts整合到mRNA序列中可显著减少脾脏中的脱靶表达，并通过整合双重靶向位点实现mRNA在肺内肿瘤细胞的精确递送。最终，在B16F10肺转移模型中，miR142ts-126ts SELECT-hELANE构建体通过三重选择策略展示了准确的肿瘤靶向和强大的肿瘤抑制能力。

5 蛋白质响应的翻译调控

RNA-蛋白质复合物由RNA和蛋白质通过非共价相互作用形成。组成RNP的RNA和蛋白质具有高亲和力和特异性。RNA结合蛋白可通过与mRNA的5'UTR结合来抑制翻译。因此，基于RNP的翻译调节器也成为调控基因表达的有力工具。L7Ae-RNP开关是一种新型调控工具。在该系统中，特定的工程化RNA与L7Ae蛋白结合。在没有L7Ae的情况下，这种调控RNA与其靶mRNA形成Watson-Crick碱基对，从而抑制mRNA的翻译。然而，当L7Ae结合后，构象变化破坏了调控RNA与靶mRNA之间的互补碱基配对，从而允许靶基因的表达。该开关能够在含有L7Ae的细胞中条件性激活靶基因表达。此外，在mRNA结构中添加可特异性结合LIN28A、L7Ae和AFP蛋白的序列，可在iPSC分化过程中进行蛋白质识别并特异性杀伤HCT116和肝癌细胞。RNP识别特定细胞内蛋白质的能力对于细胞水平基因表达的精确调控至关重要。然而，当前基于体外细胞的应用仍主要局限于蛋白质检测和靶向，这可能源于固有的设计限制。传统的RNP通常主要通过抑制mRNA翻译发挥作用，这意味着构建RNP-ON系统通常需要协调递送两种不同的mRNA才能实现RNA基机制的全部功能。同时掺入额外的调控序列和外源蛋白存在对免疫原性和潜在脱靶效应的持续担忧。此外，将两种mRNA物种共同递送到同一细胞中在技术上仍具挑战性。另一个显著限制是目前缺乏能够特异性结合多种蛋白质的、特征明确的RNA序列。

6 工程化多聚腺苷酸化翻译调控

5'UTR和3'UTR在真核生物翻译调控中起关键作用。几乎所有上述RNA器件都经过修饰的UTR设计，以实现对特定刺激的响应。此外，poly A尾也是这些合成RNA系统不可或缺的功能组件。Poly A结合蛋白可同时结合poly A和eIF4G，诱导有利于mRNA扫描、核糖体回收和蛋白质翻译的环状mRNA构象。因此，poly A对mRNA稳定性、核输出和翻译效率至关重要。工程化poly A已成为调节mRNA翻译活性的有效方法。一种方法涉及使用RNA内的信号序列将多聚腺苷酸化机制招募到转录的mRNA上。这些序列被识别为多聚腺苷酸化信号。PAS识别是多聚腺苷化的关键步骤，来自核糖开关的竞争序列可以以配体依赖性方式淬灭PAS，从而抑制多聚腺苷化过程，导致核酶介导的mRNA切割，进而调控细胞中的翻译。基于该原理，可将鸟苷响应适体与PAS序列融合以创建核糖开关。在鸟苷存在下，适体发生构象变化，隔离PAS，阻止多聚腺苷化，并使mRNA不稳定。然而，小分子和配体在细胞中缺乏特异性，使其无法用于疾病的精确治疗。研究人员提出了一种可编程控制真核生物翻译起始的基因调控策略。他们移除了靶基因的天然多聚腺苷化区域，并用含有RNA特异性结合蛋白适配器的合成控制区域替换。有帽翻译完全依赖于含有不同RBPs的起始因子工程化以选择性结合不同的eIF4F结合蛋白，从而调控基因特异性表达。为证明基于STIF的蛋白质识别在体内的治疗潜力，作者使用了癌症基因治疗的实验模型。结果表明，在接受基因传感器治疗的小鼠中，转基因肿瘤被特异性地、自给自足地消除。

7 ADAR精确编辑和调控基因表达

ADAR是一种内源性RNA编辑酶，在各种生物体中广泛表达。这些酶通过结合双链RNA并催化腺苷脱氨成为肌苷，从而改变RNA分子的核苷酸序列。肌苷不是经典RNA碱基；其与鸟苷的结构相似性使其在翻译过程中可被解释为鸟苷。因此，该酶促过程有效地导致A-to-G核苷酸转换。目前ADAR传感器主要分为两类：一类是通过体外设计靶向序列来修饰体内异常突变的UAG终止密码子；另一类是通过体外制备的RNA器件在靶基因中添加UAG，并通过识别细胞内的特定序列实现UAG向UGG的转换。研究人员开发了利用内源性ADAR进行RNA可编程编辑的平台，使用短链工程化ADAR招募RNA，该RNA专门设计用于与靶内源性转录本杂交。编辑位点配置为A:C错配，在dsRNA结构内形成A凸起，从而促进内源性ADAR酶的招募以进行位点特异性编辑。当通过AAV递送时，arRNA在体内可实现高达30%的编辑效率。此外，在Hurler综合征患者来源的成纤维细胞中成功恢复了α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。为提高编辑效率，团队开发了环化版本的arRNA，其平均编辑效率提高了3.1倍，并且由于未检测到脱靶效应而显著提高了安全性。在Hurler综合征小鼠模型中，通过AAV全身递送circ-arRNA纠正了致病点突变，恢复了α-L-艾杜糖醛酸酶活性，并减少了肝脏中糖胺聚糖的积累。该方法的可行性在临床前模型中得到进一步验证。除了纠正内源性无义突变外，ADAR传感器还可控制外源基因在靶细胞中的精确表达。在靶基因上游合成含有UAG密码子的ADAR传感器。与细胞中特定转录本形成dsRNA后，招募内源性ADAR酶将UAG密码子编辑为UGG，从而转换终止密码子并促进UGG密码子下游感兴趣基因的表达。通过这种方式，可以通过识别不同细胞类型的转录本来实现细胞水平的蛋白质精确表达。

8 条件性CRISPR系统

精确的基因编辑通常需要gRNA或 caspase 蛋白在靶细胞中的特异性表达。多种RNA器件为精确基因编辑提供了更多选择。传统的CRISPR应用缺乏时空控制，因为一旦系统激活，编辑就会持续进行。这种限制可能导致脱靶效应和细胞毒性。为解决此问题，开发了条件性CRISPR系统，主要通过两种主要策略实现精确编辑。第一种是通过使用光、小分子或抗CRISPR抗体来调节Cas9的蛋白质活性并控制其构象变化。此外，可以整合自我切割肽或降解途径等补充模块来调节Cas9活性并实现精确的时空控制。第二种是对gRNA引入修饰，例如加入光敏基团或设计核糖开关。RNA器件可以通过仅在所需条件下激活或失活CRISPR来精确控制基因组编辑。这种整合提高了安全性和精确性，拓宽了CRISPR在可控基因工程和治疗应用中的潜力。调节Cas9活性的当前策略主要是通过将附加模块整合到Cas9蛋白中，以根据环境线索调整其构象，从而能够在特定组织和时间点靶向激活或抑制Cas9。4-羟基他莫昔芬是常用于抑制Cas9活性的小分子。研究人员通过在他莫昔芬响应肽添加到Cas9活性位点来设计Cas9变体。在他莫昔芬存在下，Cas9蛋白发生构象变化，诱导自我切割并移除肽段，从而恢复其原始功能。此外，将一些光控模块添加到Cas9也是常见方法。由于未进行进一步的疾病诊断和治疗研究，且光控、小分子和荧光素酶触发并非细胞特异性，此处不深入讨论。研究人员开发了一个名为mCTA的条件性编辑系统，该系统整合了toehold和miRNA分子开关。通过流体动力学注射到小鼠体内后，mCTA特异性识别肝脏特异性miR-122并触发Cas9蛋白的表达。在gRNA的指导下，该系统编辑7*TRE和P_CMVmini调控区域，从而诱导下游荧光素酶报告基因的特异性表达。gRNA是一种可根据碱基配对规则诱导的核酸分子，对于激活Cas9至关重要。其尺寸比Cas9蛋白小，有利于其合成、修饰和筛选。当前常见方法包括向gRNA添加toehold开关、核糖开关和光传感元件。研究人员将gRNA与核糖开关整合，开发了第一个序列响应性CRISPR/Cas9系统。该系统将一个人工RNA接头整合到gRNA的3'末端。在没有序列结合的情况下，gRNA保持闭合构象。当序列结合后，结构发生变化，释放引导区域以结合靶DNA。这种修饰的CRISPR/Cas9系统能够在特定分子控制下定量调节基因转录。研究人员进一步构建了各种逻辑门，并在膀胱癌和裸鼠模型中评估了该系统。通过响应促肿瘤信号并激活抗癌通路，该系统实现了肿瘤特异性细胞杀伤。

9 讨论

工程化RNA器件是实现精准RNA疗法的前沿领域。这些分子系统，如toehold开关、ADAR传感器和miRNA响应电路，充当分子计算机，检测细胞内生物标志物（例如疾病相关RNA、蛋白质或miRNA），并触发上下文依赖性响应，包括基因编辑、治疗性蛋白质表达或受控载荷释放。RNA器件与先进递送平台的整合代表了体内靶向治疗诊断学的范式转变，弥合了分子识别与临床行动之间的差距。本综述重点介绍了RNA器件如何利用其可编程性、低免疫原性和模块化设计，与尖端递送系统配对，在器官或细胞水平实现时空控制的诊断和治疗。未来进展应侧重于克服关键瓶颈——特别是在RNA序列设计和开发能够靶向肝外组织的递送系统方面。整合新兴技术至关重要。人工智能可以分析大规模RNA结构-功能数据集，使用深度学习算法预测折叠模式并合理设计功能性RNA组件。这种方法将增强特异性，提高设计效率并降低生产成本。此外，多组分RNA器件将通过感知多个细胞内信号（转录本或蛋白质）并支持动态、分层控制基因表达，来支持复杂的逻辑操作（如"AND"、"OR"和"NOT"）。另一个关键前沿是创建靶向肝外特定器官（如大脑和肾脏）的递送系统。智能RNA器件与靶向递送平台的协同作用将有助于克服传统RNA疗法的局限性，包括组织特异性差和安全问题。这对从遗传病（通过RNA编辑）和癌症免疫治疗到神经退行性疾病和再生医学的一系列应用具有广阔前景。