《Animal Science Journal》：Variations in Plasma Metabolome Shed Light on the Associations Between Lipid Metabolism and Oxidative Stress in Goats Supplemented With Condensed Tannin
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该研究通过拉丁方设计，评估了在山羊日粮中添加2%浓缩单宁（CT）对血浆代谢组及氧化应激的影响。实验以燕麦和大麦为基础饲料，结果显示CT显著降低氧化应激水平，其中燕麦基础日粮组（BACT/BA）的氧化应激抑制效果更显著。代谢组学分析表明，CT通过调节胆汁酸合成（如脱氧胆酸、胆酸）和氨基酸代谢（如苯丙氨酸、色氨酸）影响脂代谢，且与抗氧化指标（SOD、TRP、T-AOC）呈显著相关性。该研究揭示了CT对脂代谢和抗氧化能力的调控机制，为优化反刍动物健康策略提供了依据。
本研究探讨了在动物日粮中添加2%（按干物质计算）的缩聚单宁（CT）对山羊血浆代谢组和氧化应激的影响。为了评估这种影响，研究者分别使用大麦（BA）和玉米（CN）作为碳水化合物来源，构建了对照日粮以及添加CT的日粮（BACT和CNCT）。实验采用了重复的4×4拉丁方设计，共有8只健康的日本柴犬×山羊杂交公山羊参与，每个处理周期持续28天。在每个周期的最后一天，采集了山羊的血浆样本，并利用超高效液相色谱-串联质谱分析（UPLC-MS）对样本进行了全面分析。研究发现，添加CT的日粮在山羊血浆代谢组中主要与初级胆汁酸的生物合成和氨基酸代谢有关，并且CT的添加对脂质代谢也表现出显著的关联。此外，CT的添加显著降低了氧化应激水平，尤其是在大麦为基础的日粮（BACT/BA）中，其效果比在玉米为基础的日粮（CNCT/CN）中更为明显。进一步的关联分析表明，血浆中的反应性分子与初级胆汁酸生物合成相关的代谢物呈负相关关系。这项研究不仅揭示了血浆代谢组与氧化应激之间的关系，还为利用CT提升反刍动物健康和生产性能提供了新的思路。
在过去的数十年里，植物多酚，尤其是缩聚单宁，因其对反刍动物有益的特性而受到广泛关注。研究表明，缩聚单宁具有抗胀气、抗菌和抗氧化等多种功能，这使得它成为畜牧业中一个极具潜力的添加剂。目前，对缩聚单宁的研究主要集中于其来源，如Quebracho，这种植物的缩聚单宁在制造和农业应用方面均有广泛使用，尤其是在南美和拉丁美洲的畜牧业中。缩聚单宁通过与营养物质、氧化刺激物（如二氧化硫和一氧化氮）等分子结合，影响特定微生物群落，从而改变其代谢产物。尽管这种特性可能带来一些抗营养效应，阻碍营养物质的消化和吸收，但已有研究显示，当缩聚单宁添加量在2%至3%的干物质范围内时，其在动物胃肠道中的非降解性和低吸收性可以确保其安全和广泛的应用，尤其是在与水解单宁相比时，后者具有水溶性和毒性。
虽然缩聚单宁在血浆中几乎无法检测到，但它对宿主（特别是其抗氧化能力）具有积极影响。例如，一项研究显示，在放牧母羊的饮食中添加52.8克/千克的缩聚单宁可以显著降低血浆脂质氧化产物丙二醛（MDA）的浓度，从而减少氧化应激。另一项研究则发现，当山羊每日摄入20、30和40毫克/千克体重的缩聚单宁时，其肌肉中的超氧化物歧化酶（SOD）浓度呈现出线性增加的趋势。考虑到血浆代谢物可以作为诊断抗氧化能力的生物标志物，研究这些代谢物的变化有助于理解缩聚单宁如何影响宿主健康。然而，目前关于缩聚单宁对山羊血浆代谢组变化的影响，以及血浆代谢组与抗氧化状态之间的相关性，尚缺乏全面的概述。
近期的研究表明，缩聚单宁对宿主营养代谢的影响依赖于日粮成分。在实际的畜牧生产中，反刍动物需要大量能量底物来满足生产需求，而大麦和玉米作为两种主要的能量底物，其在日粮中的应用十分广泛。大麦在蛋白质含量和快速降解淀粉比例上均优于玉米，因此其在瘤胃中的降解速度和程度也更高。相比之下，玉米的蛋白质含量较低，但其淀粉的缓慢降解特性意味着其在瘤胃中的降解速度较慢。这些差异可能影响瘤胃的酸碱度，从而进一步影响血浆的抗氧化能力。基于这些差异，研究者假设，缩聚单宁的添加可能通过改变血浆代谢组来增强宿主的抗氧化状态。同时，他们预测这些影响会因日粮中的不同成分而有所差异，主要是由于缩聚单宁与淀粉和蛋白质在胃肠道中的亲和力不同。这种亲和力的差异可能导致不同代谢物被吸收进入血浆。因此，本研究旨在利用山羊作为动物模型，明确血浆代谢组与抗氧化状态之间的网络关系。
本研究在获得岐阜大学动物研究与福利委员会的批准（批准号：#2021-175）的前提下进行，并遵循了日本科学理事会关于动物实验的指南（2006）以及岐阜大学的动物研究与福利指南（2008）。研究采用8只被阉割的、健康的日本柴犬×山羊杂交公山羊，这些山羊具有相似的平均体重（34.4±2.1千克）和身体状况，且年龄相同（2岁）。这些山羊被分配到重复的4×4拉丁方设计中，分别测试了四种不同的日粮：以大麦为基础的日粮（BA）、添加2%（按干物质计算）缩聚单宁的大麦日粮（BACT）、以玉米为基础的日粮（CN）和添加2%缩聚单宁的玉米日粮（CNCT）。这些日粮的配方确保了相似的能量和蛋白质水平，符合《小型反刍动物营养需求》（NRC，2007）的标准。每个周期持续28天，山羊在整个试验过程中被单独饲养在代谢笼中（0.8×1.2米）。然而，由于两只山羊在第三周期中状态不佳，其数据被排除在分析之外。缩聚单宁是从阿根廷的Quebracho Colorado树中提取的粉末，其典型组成至少为75%的缩聚单宁，其他成分如儿茶素、表儿茶素、没食子酸和表没食子酸均低于15%。在第28天进行采血时，山羊被禁食10小时。血液通过10毫升的真空管采集，其中含有EDTA（Venoject II：Terumo Co. Ltd.，东京，日本），随后在3000转/分钟、4摄氏度下离心15分钟以获得血浆，并立即冷冻在-80摄氏度下保存。在分析当天，血浆样本被解冻并在冰上涡旋30秒以确保均匀性。
在生化指标方面，研究者关注了能量底物（葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇）、蛋白质代谢（总蛋白、尿素氮和氨）以及肝功能（丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST）。通过将10微升血浆样本涂抹在特定的多层分析膜上，并使用DRI-CHEM临床化学系统（4000V，富士胶片，东京，日本）进行比色法分析，这些指标得以测定。此外，为了评估氧化应激，研究者选择了丙二醛（MDA）、非酯化脂肪酸（NEFA）和一氧化氮（NO?）作为氧化指标，并测量了超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、总还原能力（TRP）和总抗氧化能力（T-AOC）以反映抗氧化条件。所有指标均通过分光光度法进行测定，测量过程严格遵循制造商的说明。
为了进行代谢组分析，研究者首先将每只山羊的300微升血浆稀释在1190微升的甲醇中，并加入10微升的山奈酚（浓度为1毫克/毫升，溶于甲醇）作为内标物。质量控制（QC）通过从稀释后的血浆中取200微升进行平衡和归一化，以确保质谱结果的准确性。样品和QC样本在涡旋3分钟后，于-20摄氏度下冷却30分钟。随后，样品在16000转/分钟、4摄氏度下离心15分钟，取上清液进行液相色谱-质谱分析（LC-MS）。非靶向代谢组分析使用了配备C18分析柱（ACQUITY UPLC BEH C18；2.1毫米×100毫米，Waters）的超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪（UPLC-QTOF-MS，Xevo QToF，Waters，Milford，MA）。流动相由0.1%甲酸（A，稀释于UPLC级去离子水）和乙腈（B）组成。流速为0.4毫升/分钟，样品进样体积为5.0微升。梯度洗脱程序如下：0分钟，95% A；3分钟，80% A；9-13分钟，5% A；13.10分钟，95% A；并保持在95%直至16分钟。电喷雾电离在正负模式下进行。质谱仪在MS/MS模式下运行，其参数设置为：毛细管电压2.5千伏；源内碰撞诱导解离30伏；脱溶剂温度500摄氏度；源温度150摄氏度。MS1和MS2数据在MSE模式下采集，扫描范围为50-1000 m/z，每扫描0.5秒。低和高碰撞能量分别设置为6伏和从15伏到45伏，适用于正负离子模式。
在数据处理和多变量统计分析方面，原始质谱数据通过AnalysisBaseFile Converter（Reifycs Inc.，东京，日本）转换为.abf格式，并使用MS-DIAL（Ver. 4.9；Tsugawa等，2015）进行处理。保留时间偏移、质量准确性和峰面积相对标准偏差分别设置为0.3分钟、5 mDa和30%。检测到的离子与MS-DIAL内置数据库进行匹配，总得分高于700的代谢物被认为是已鉴定的代谢物。随后，MS-DIAL的结果被转换为.csv格式，并通过MetaboAnalyst（Ver. 5.0；
https://www.metaboanalyst.ca/；Pang等，2022）进行分析，并使用内标物和对数转换进行归一化处理。归一化后的数据在SIMCA软件包（Ver. 17；MKS Data Analytics Solutions，Ume?，瑞典）中进行非监督主成分分析（PCA）、监督正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以及OPLS-DA结果的置换测试。为了进一步细化这些结果，研究者在MetaboAnalyst中生成了火山图，以概览控制组与CT添加组之间的代谢物变化。随后计算了第一主成分的变量重要性投影（VIP）、Student's t检验和对数2倍变化（log2FC）。VIP值大于1且P值小于0.05的代谢物被认为是控制组与CT添加组之间的显著差异。最终，识别出的代谢物通过MetaboAnalyst内置的通路分析进行进一步研究，受影响通路的验证基于牛代谢组数据库（BMDB）、人类代谢组数据库（HMDB）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）。
为了探索CT对不同代谢物（VIP > 1且P < 0.05）与氧化还原指标之间的相关性，研究者使用R软件中的pheatmap和psych包进行了皮尔逊相关系数分析。P值小于0.05的关联被定义为显著相关。
为了确定是否存在显著的代谢组差异，研究者比较了以大麦为基础的日粮与添加2% CT的大麦日粮（BA vs. BACT），以及以玉米为基础的日粮与添加2% CT的玉米日粮（CN vs. CNCT）之间的差异。数据包括血液生化指标和氧化应激指标，并使用SPSS软件（v20.0，IBM，Armonk，NY，美国）按照以下模型进行分析：
$$ Y_{ij} = μ + τ_i + β_j + ε_{ij} $$
其中，$ Y_{ij} $ 代表因变量，$ μ $ 代表总体均值，$ τ_i $ 代表固定效应的日粮处理，$ β_j $ 代表随机效应的山羊在方块内的影响，$ ε_{ij} $ 代表残差误差。结果以均值±均值标准误（SEM）的形式呈现。通过t检验比较均值差异，P值小于0.05被认为是显著的。
在实验结果部分，研究者首先分析了山羊的生产性能。结果显示，无论哪种处理，山羊均能完全消耗所提供的饲料（P > 0.05；表S2），且实验结束后体重变化不大（P > 0.05），表明其对饲料的摄入和体重变化没有显著影响。
接下来，研究者分析了血浆生化指标。结果显示，BACT组的血浆胆固醇浓度显著高于BA组（P < 0.01；表1），而CNCT组的胆固醇浓度也显著高于CN组（P = 0.02）。尿素氮的含量在BACT组中显著高于BA组（P < 0.01）。CT补充对甘油三酯水平的影响取决于基础日粮，BACT组的甘油三酯水平低于BA组（P < 0.01），但CNCT组的甘油三酯水平高于CN组（P < 0.01）。其他指标，如葡萄糖、总蛋白、白蛋白、ALT和AST，各处理组之间差异不显著（P > 0.05）。
在多变量和通路变化分析中，研究者识别了正负离子模式下的1217和393个MS峰。通过与MS-DIAL数据库进行结构相似性比较，这些有效的峰对应了130个正离子代谢物和87个负离子代谢物（表S3）。所有样本的PCA和OPLS-DA得分图均位于95%的Hotelling T2椭圆内（图1）。图中显示，CNCT与CN组在负离子模式下表现出明显的PCA图分离，而CNCT/CN组在正离子模式下以及BACT/BA组在正负离子模式下仅表现出部分分离。无论使用哪种MS模式，OPLS-DA图中控制组与CT补充组之间均存在显著的分离。所有置换测试的R2Y截距均高于0.3，Q2接近1，表明OPLS-DA模型具有良好的解释力和预测能力。在正离子模式的火山图中，BACT/BA组发现了5个不同的代谢物，而CNCT/CN组发现了14个不同的代谢物（图2A、B）；在负离子模式中，BACT/BA组发现了10个不同的代谢物，而CNCT/CN组发现了63个不同的代谢物（图2C、D）。
通过将所有不同的代谢物映射到KEGG数据库，研究者发现，以大麦为基础的日粮在添加CT后对初级胆汁酸生物合成产生了显著影响（图3A）。此外，以玉米为基础的日粮在添加CT后不仅影响了初级胆汁酸生物合成，还显著影响了甘油磷脂代谢和氨基酸生物合成及代谢（图3B）。在我们的研究中，观察到BACT组的胆酸（如胆酸和甘油胆酸）浓度显著增加，这些胆酸属于初级胆汁酸，主要由肝细胞代谢胆固醇产生，其在肠道中促进脂质吸收（Hofmann，1999）。因此，BACT组的胆酸浓度增加可能表明，CT促进了肠道脂质的积累和利用。此外，一项研究发现，当在小鼠日粮中添加柿子单宁时，粪便中的胆酸分泌增加（Nishida等，2021）。由于胆酸有助于将肠道中的脂质分子运输到肠上皮细胞中，促进脂质的吸收和利用，因此这一结果支持了我们的推测，即CT可能通过促进肠道脂质利用来提高血浆总胆固醇浓度。此外，初级胆汁酸生物合成的增强也支持了CT对脂肪酸合成有益的结论（Frutos等，2020）。
在另一个方面，初级胆汁酸的作用还包括帮助清除肠道中的多余刺激物，从而防止这些刺激物对宿主造成氧化损伤（Jia等，2018）。这一结论在其他动物研究中也有所体现。例如，Cao等（2021）在试验的第29至42天期间，随着胆酸的逐渐增加，发现小猪的总抗氧化能力（T-AOC）呈线性上升趋势。Yin等（2021）也发现，在肉鸡日粮中添加200毫克/千克的胆酸可以有效缓解热应激引起的氧化损伤，提高血浆中的谷胱甘肽过氧化物酶水平。与这些研究一致，本研究中发现，BACT组的SOD、TRC和T-AOC含量均显著高于BA组，表明CT在大麦日粮中增强了山羊的抗氧化能力。此外，皮尔逊分析还表明，甘油胆酸与SOD和TRP呈正相关，与脂质过氧化产物MDA呈负相关。尽管甘油胆酸在肝脏中具有一定的毒性，但其在人体中的抗氧化能力也得到了关注（Vaz等，2010）。最近的一项研究指出，人体血浆中缺乏这种代谢物可能直接表明胆汁淤积（Li等，2020）。因此，CT在大麦日粮中降低山羊的氧化应激，可能通过平衡脂质生成与分解来实现。值得注意的是，BACT组的苯乙酰甘氨酸浓度较BA组有所下降。之前的研究表明，苯乙酰甘氨酸是磷脂质代谢异常产物（Delaney等，2004），因此这种代谢物的减少可能表明CT不仅通过增加胆酸含量来降低氧化应激，还可能通过减少脂质代谢过程中产生的副产物来实现这一效果。
相比之下，CNCT/CN组在血浆代谢组中表现出显著变化。除了初级胆汁酸生物合成外，CT的添加还增强了甘油磷脂代谢和氨基酸代谢。据报道，当反刍动物摄入大量易发酵底物时，瘤胃中的酸性环境会促进CT与饮食成分的结合，从而减少瘤胃中蛋白质的消化（Huang等，2018；Vasta等，2019）。随后，肠道中的较高pH值会促进CT复合物的解离（McSweeney等，2001）。因此，苯丙氨酸代谢的增强可能反映了CT对肠道蛋白质利用的促进，这与Barry和McNabb（1999）的研究结果一致。值得注意的是，苯丙氨酸和酪氨酸是脂质代谢中的关键氨基酸（Flydal和Martinez，2013），因此这两种氨基酸的浓度增加与血浆中总胆固醇浓度的升高密切相关。
此外，研究者观察到抗氧化指标与溶血磷脂酰胆碱（LPC）之间存在显著的相关性，LPC在血液中的出现表明脂质代谢增强。然而，动物相关的LPC数据仍然有限，其在血液中的功能尚存争议。Matsumoto等（2007）将LPC定义为一种炎症因子，因为它在人类和小鼠中的动脉粥样硬化作用。相反，Yan等（2004）发现，在体外和体内实验中，LPC对小鼠具有抗病原性作用。由于本研究中发现CNCT组的LPC水平变化不大，且MDA和NEFA在CNCT与CN组之间差异不显著，这表明山羊在玉米日粮中并未表现出过量的脂质过氧化或脂质动员的不平衡，同时其氧化应激水平也有所下降，这支持了LPC对宿主有益功能的假设。
综上所述，本研究首次展示了在不同谷物为基础的日粮中添加缩聚单宁对山羊血浆代谢组和氧化应激的影响。确实，两种日粮的反应存在显著差异。Soldado等（2021）指出，缩聚单宁在不同日粮中的干预可能会导致宿主反应的差异，这可能是由于缩聚单宁与日粮成分之间复杂的相互作用。其中一个合理的因素是大麦和玉米在消化道中通过速度的差异，这可能导致缩聚单宁在不同日粮中发挥功能的时间不同。此外，缩聚单宁与日粮成分（如纤维具有较高的亲和力，而淀粉亲和力较低）之间的不同亲和力也应加以考虑。最后，由于大麦日粮在瘤胃中迅速降解，可能导致瘤胃pH值的急剧下降，从而对宿主的吸收和分布系统造成负担，这可能解释了BACT/BA组中MDA和NEFA水平的变化与CNCT/CN组的不同。因此，CT在大麦日粮中降低氧化应激可能更倾向于“缓解”而非“调控”。
本研究的结果表明，缩聚单宁的添加可以显著降低山羊的血浆氧化应激。此外，抗氧化能力与血浆脂质代谢之间存在强相关性，这种影响依赖于基础日粮的成分。总结而言，缩聚单宁在以大麦为基础的日粮中显著改变了血浆中的初级胆汁酸生物合成，而在以玉米为基础的日粮中，缩聚单宁则影响了血浆代谢物，包括初级胆汁酸生物合成和苯丙氨酸代谢，这些通路与脂质代谢密切相关。因此，本研究的结果有助于更深入地理解脂质代谢与氧化应激之间的关系，并支持了将缩聚单宁作为提升反刍动物健康和生产性能的策略。
