去甲异波尔定通过选择性抑制谷氨酰胺分解下调α-酮戊二酸水平从而抑制γδT17细胞活化缓解小鼠银屑病样皮炎

《Journal of Advanced Research》：Norisoboldine restrains γδT17 cell activation and consequently alleviates psoriasis-like dermatitis in mice by selectively down-regulating glutaminolysis to decrease the level of α-ketoglutarate

本研究聚焦于银屑病治疗新策略，探讨了去甲异波尔定（NOR）如何通过靶向γδT17细胞的代谢重编程来缓解疾病。研究人员发现NOR能选择性下调谷氨酰胺分解关键酶GLS1表达，降低代谢产物α-KG水平，进而抑制组蛋白去甲基化酶KDM6b活性，增加RORγt启动子区H3K27me3修饰，最终抑制γδT17细胞活化和IL-17产生。该研究揭示了代谢-表观遗传交叉调控在银屑病发病中的作用，为开发新型疗法提供了理论依据。

　　

银屑病是一种困扰全球数千万患者的慢性炎症性皮肤疾病，其特征是皮肤出现红斑、鳞屑和斑块，给患者带来极大的身心痛苦。尽管针对白细胞介素17（IL-17）的单克隆抗体在临床上显示出良好的治疗效果，但约30%的患者反应不佳，且存在感染和过敏反应等副作用风险。在银屑病患者的真皮中，γδT17细胞是IL-17的主要来源细胞，因此靶向抑制γδT17细胞的活化成为治疗银屑病的潜在策略。

近年来，免疫代谢研究揭示细胞代谢重编程在免疫细胞功能调控中发挥关键作用。与偏向糖酵解的γδT1细胞不同，γδT17细胞更倾向于利用谷氨酰胺代谢、氧化磷酸化或脂质代谢来满足其能量需求。在γδT17细胞活化过程中，参与谷氨酰胺代谢的氨基酸水平显著降低，提示谷氨酰胺代谢可能在γδT17细胞功能调控中扮演重要角色。然而，能否通过调节谷氨酰胺代谢来抑制γδT17细胞活化，从而治疗银屑病，尚不清楚。

在这项发表于《Journal of Advanced Research》的研究中，中国药科大学的研究团队深入探讨了从中药乌药中分离得到的异喹啉生物碱——去甲异波尔定（Norisoboldine, NOR）是否通过调控谷氨酰胺代谢来影响γδT17细胞活化，进而缓解银屑病样皮炎。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用咪喹莫特（IMQ）诱导的小鼠银屑病样皮炎模型进行体内药效评价；通过磁珠分选技术从小鼠肠系膜淋巴结中分离纯化γδT细胞进行体外培养；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞内代谢物水平；运用流式细胞术分析免疫细胞比例；通过蛋白质印迹法（Western blot）和定量聚合酶链反应（qPCR）检测蛋白和基因表达水平；利用染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）技术分析组蛋白修饰状态；并采用质粒转染和小干扰RNA（siRNA）干扰技术进行基因功能增益和缺失研究。

Norisoboldine alleviates IMQ-induced psoriasis-like dermatitis in mice

研究人员首先建立了IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎模型，并观察了NOR的治疗效果。结果显示，皮下注射NOR（20, 40 mg/kg）能显著改善IMQ引起的小鼠皮肤鳞屑、红斑和表皮增厚，降低银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分。组织病理学检查发现，NOR治疗可逆转表皮增厚和棘皮症，减少真皮层炎症细胞浸润。同时，NOR还下调了皮肤中IL-6、TNF-α和IL-22的mRNA表达水平，表明NOR能有效缓解银屑病样皮炎。

Norisoboldine attenuates γδT17 cell activation in vivo and in vitro

为进一步探究NOR的作用机制，研究人员检测了NOR对γδT17细胞活化的影响。体内实验表明，NOR处理显著降低了银屑病样皮炎小鼠皮肤和脾脏中γδT17细胞的比例，并下调了IL-17和RORγt的mRNA表达。体外实验中，NOR（3, 10 μM）处理能降低γδTCR⁺IL-17⁺ T细胞的比例，并抑制IL-17A、IL-17F、TNF-α、IL-22以及转录因子RORγt、SOX4和SOX13的mRNA表达。这些结果证实NOR在体内外均能抑制γδT17细胞的活化。

Norisoboldine restrains the activation of γδT17 cells by down-regulating glutaminolysis

研究团队接着探讨了NOR抑制γδT17细胞活化的代谢机制。他们发现，在γδT17细胞活化条件下，NOR能选择性下调谷氨酰胺分解限速酶GLS1的表达，而对脂肪酸氧化、糖酵解、脂肪酸合成或氧化磷酸化相关关键酶的表达无显著影响。代谢物检测显示，NOR处理逆转了活化γδT17细胞中谷氨酰胺及其代谢物（包括谷氨酸、α-酮戊二酸、2-羟基戊二酸、富马酸、琥珀酸和异柠檬酸）水平的改变。功能实验表明，谷氨酰胺剥夺可抑制γδT17细胞活化，而外源性谷氨酰胺补充则促进其活化；GLS1抑制剂BPTES能模拟NOR的抑制作用；而过表达GLS1则能逆转NOR对γδT17细胞活化的抑制效应。这些结果证明NOR通过选择性抑制谷氨酰胺分解来限制γδT17细胞活化。

Norisoboldine restricts γδT17 cell activation by down-regulating the level of glutaminolysis metabolite α-KG

为了确定NOR通过影响谷氨酰胺分解的哪个环节发挥作用，研究人员外源性添加了谷氨酸及其下游代谢物。结果发现，添加谷氨酸、α-KG和2-HG能上调IL-17A和RORγt的mRNA表达，并削弱NOR的抑制作用，而富马酸、琥珀酸和异柠檬酸则无此效应。进一步的基因干扰实验显示，敲低谷氨酸脱氢酶（GLUD）能废除谷氨酸对γδT17细胞活化的促进作用，而敲低异柠檬酸脱氢酶1/2（IDH1/2）对α-KG的促进作用无显著影响。此外，外源性添加α-KG能明显减弱NOR引起的γδT17细胞比例下降。这些结果表明NOR通过下调谷氨酰胺分解代谢产物α-KG的水平来限制γδT17细胞活化。

Norisoboldine down-regulates α-KG level to restrict γδT17 cell activation by suppressing the expression of KDM6b

α-KG是多种α-KG依赖性双加氧酶的必需辅因子，参与表观遗传调控。研究人员检测了NOR对几种α-KG依赖性酶表达的影响，发现NOR能特异性下调组蛋白去甲基化酶KDM6b的mRNA和蛋白表达，而对TET2、TET3、PHD3、KDM5和KDM4的表达无显著影响。KDM6b抑制剂GSK-J4能模拟NOR的效应，下调IL-17A、IL-17F和RORγt的mRNA表达。外源性添加α-KG能逆转NOR引起的KDM6b表达下调。更重要的是，过表达KDM6b能显著削弱NOR对γδT17细胞比例和IL-17A、RORγt mRNA表达的抑制作用。这些发现表明NOR通过下调α-KG水平来抑制KDM6b表达，进而限制γδT17细胞活化。

Norisoboldine suppresses the expression of KDM6b to restrain demethylation of histone H3K27 in the RORγt promoter of γδT17 cells

KDM6b是特异性催化组蛋白H3K27去甲基化的酶。研究人员发现，NOR处理能显著提高γδT17细胞中组蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）的整体水平。通过ChIP-qPCR分析RORγt启动子区不同片段（P1-P5）的H3K27me3水平，他们发现NOR主要增加了P3片段的H3K27me3水平。这一效应可被KDM6b过表达或外源性α-KG添加所逆转。这些结果说明NOR通过抑制KDM6b表达，阻止了RORγt启动子区H3K27的去甲基化，从而抑制RORγt转录和γδT17细胞活化。

Norisoboldine restricts γδT17 cell activation to alleviate psoriasis-like dermatitis in mice by suppressing glutaminolysis

最后，研究人员在动物模型中验证了谷氨酰胺代谢在NOR治疗作用中的重要性。结果显示，腹腔注射α-KG（100 mg/kg）能上调银屑病样皮炎小鼠皮肤和脾脏中γδT17细胞的比例，增强皮肤中IL-17A和RORγt的mRNA表达，并显著削弱NOR对银屑病样皮炎症状（包括红斑、鳞屑、皮肤增厚和PASI评分）的改善作用。组织病理学检查和炎症因子检测也证实，α-KG能逆转NOR对表皮增厚、角化过度和促炎细胞因子表达的抑制作用。这些体内实验数据充分证明NOR通过抑制谷氨酰胺分解，特别是减少α-KG的产生，来限制γδT17细胞活化，从而缓解银屑病样皮炎。

研究结论与讨论部分指出，本研究首次揭示了NOR通过调控"谷氨酰胺分解-α-KG-KDM6b-H3K27me3"轴来抑制γδT17细胞活化的新机制。与现有的广谱谷氨酰胺代谢抑制剂或表观遗传调节剂相比，NOR表现出更具选择性的调节特点，它下调而非完全阻断谷氨酰胺代谢，可能避免引起广泛的免疫抑制。该研究不仅阐明了代谢与表观遗传交叉对话在银屑病发病机制中的重要作用，也为开发针对γδT17细胞活化的相关疾病的新疗法提供了有前景的候选药物和理论依据。未来研究需要进一步明确NOR在γδT17细胞中的直接分子靶点，并探索其对其他免疫细胞类型的潜在影响。