高效选择性PROTAC CDK9降解剂dCDK9-202的发现及其强效体内抗肿瘤活性研究

《Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery of dCDK9-202 as a Highly Potent and Selective PROTAC CDK9 Degrader with Strong In Vivo Antitumor Activity

本研究针对CDK9抑制剂因ATP结合位点高度同源而面临的选择性差、临床转化难等挑战，基于PROTAC技术设计合成了一系列新型CDK9降解剂。代表性化合物dCDK9-202在TC-71细胞中展现出3.5 nM的DC50值和>99%的Dmax，对多种癌细胞系具有纳摩尔级抑制活性，且通过静脉给药显著抑制小鼠肿瘤生长而无毒性迹象，为CDK9成瘾性肿瘤治疗提供了极具前景的临床前候选化合物。

　　

在癌症治疗领域，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）家族一直是备受关注的热点靶点。其中，CDK9通过调控RNA聚合酶II（Pol2）的羧基末端结构域（CTD）丝氨酸2位点（Ser2）磷酸化，在转录延伸过程中发挥关键作用，其异常活化与多种血液肿瘤和实体瘤的发生发展密切相关。然而，由于CDK家族成员ATP结合口袋的高度相似性，传统小分子抑制剂难以实现针对CDK9的高选择性抑制，往往导致脱靶效应和剂量限制性毒性，这成为制约CDK9靶向疗法临床转化的主要瓶颈。

面对这一挑战，蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术应运而生。这种新兴策略通过双功能分子同时招募靶蛋白和E3泛素连接酶，利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）特异性降解疾病相关蛋白，展现出克服耐药性、增强活性和提高选择性的独特优势。尽管已有研究报道了基于BAY1143572、NVP-2等抑制剂的CDK9降解剂，但这些化合物仍存在选择性低或活性不足等问题。因此，开发兼具高活性、高选择性和良好药代动力学特性的新型CDK9降解剂成为当前研究的迫切需求。

在这项发表于《Journal of Medicinal Chemistry》的研究中，浙江大学医学院附属第二医院癌症研究所的林马（Lin Ma）团队通过合理设计，将CDK9抑制剂SNS032与新型高效cereblon（CRBN）E3连接酶配体TX-16相结合，构建了一系列PROTAC CDK9降解剂。研究人员采用计算机辅助分子对接技术，确定SNS032的哌啶基团和TX-16的吡咯烷基团作为理想的连接位点，通过系统优化连接链长度和组成，成功获得了活性显著提升的降解剂候选化合物。

为开展此项研究，团队主要运用了以下关键技术：基于AutoDock软件的分子对接设计、有机合成化学方法构建PROTAC分子库、蛋白质印迹法（Western blotting）评估靶蛋白降解效率、MTT法检测细胞增殖抑制、体内药代动力学（PK）和药效学（PD）分析、以及RNA测序（RNA-seq）技术解析转录组变化。特别值得注意的是，研究涉及的TC-71细胞系来源于转移性尤文肉瘤患者，其他测试细胞系覆盖了肺癌、肝癌、骨癌和脑癌等多种肿瘤类型。

设计合成基于新型高效CRBN配体的CDK9降解剂

研究人员首先设计合成了化合物11-18，通过改变连接链中亚甲基数目（n=1-8）系统优化降解活性。在TC-71细胞中的评估结果显示，所有化合物均能有效诱导CDK9降解，其中连接链长度为5-8个亚甲基的化合物12-15表现出最优活性，DC₅₀值达到1.5-3.5 nM。为进一步改善溶解性，团队又合成了含氧原子的连接链衍生物19-21，但降解活性相对较弱。作为阴性对照的化合物22由于CRBN配体氨基上的甲基化修饰，完全丧失了降解能力，证实了PROTAC作用的特异性。

评估高效CDK9降解剂对TC-71细胞的生长抑制作用

细胞活性实验表明，代表性化合物dCDK9-202（14）在TC-71细胞中的IC₅₀值为8.5 nM，显著优于母体抑制剂SNS032（6，48.9 nM）和已报道降解剂THAL-SNS032（10，21.6 nM）。动力学研究显示，dCDK9-202处理2小时内即可快速降低CDK9蛋白水平，8小时达到近完全降解。机制验证实验证实，其降解作用可被SNS032、沙利度胺、MG132和MLN4924预处理所抑制，确认为典型的PROTAC降解机制。

dCDK9-202在多癌种中的广谱抗肿瘤活性

除TC-71细胞外，dCDK9-202在胶质母细胞瘤（U87）、子宫平滑肌肉瘤（SKUT1）和横纹肌肉瘤（RH5）等多种癌细胞系中均展现出强大的CDK9降解能力，DC₅₀值均低于10 nM。功能实验表明，dCDK9-202处理能显著抑制BrdU掺入，激活caspase-3/7，并诱导cleaved caspase-3和cleaved PARP表达，证实其通过抑制增殖和促进凋亡发挥抗肿瘤作用。在涵盖肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、白血病等13种癌细胞系的测试中，dCDK9-202均表现出纳摩尔级的抑制活性。

dCDK9-202的高选择性及转录组影响

靶点选择性评估显示，dCDK9-202能特异性降解CDK9，而对CDK1/2/4/5/6/7/8/11/12及CRBN经典底物IKZF1/3无明显影响。分子机制研究表明，dCDK9-202有效抑制Pol2 CTD^Ser2磷酸化，并下调MYC、E2F1、MCL1和BCL-xL等癌基因和抗凋亡蛋白表达。RNA-seq分析进一步揭示，dCDK9-202处理引起2600多个基因下调，显著富集于细胞周期、DNA复制、MYC靶点和E2F靶点等致癌通路，而SNS032在相同条件下对全局基因表达影响甚微。

dCDK9-202的体内药代动力学和抗肿瘤功效

小鼠药代动力学研究显示，dCDK9-202经静脉给药后呈现中等水平的暴露量。药效学实验证实，单次10 mg/kg剂量即可在2小时内显著降低肿瘤组织CDK9蛋白水平。在TC-71移植瘤模型中，dCDK9-202治疗组肿瘤体积和重量均显著减小，且未引起小鼠体重下降等毒性反应，疗效明显优于SNS032和THAL-SNS032对照组。肿瘤组织分析进一步验证了dCDK9-202组CDK9降解效果最为显著。

本研究成功开发出具有高选择性和强效抗肿瘤活性的PROTAC CDK9降解剂dCDK9-202。该化合物在纳摩尔浓度下即可高效降解CDK9，通过破坏Pol2功能和相关致癌转录程序，在多种癌细胞系和动物模型中展现出优越的治疗效果。尤为重要的是，dCDK9-202克服了传统CDK9抑制剂的选择性难题，且体内应用安全耐受，为推进CDK9成瘾性肿瘤的临床治疗提供了极具潜力的候选药物，也为基于PROTAC技术的蛋白靶向降解策略提供了重要范例。这项研究不仅深化了对CDK9生物学功能的理解，也为开发新一代转录调控靶向疗法开辟了新途径。