优化SARS-CoV-2 RNA提取方法提升废水样本病毒RNA回收率的研究

《Journal of Microbiological Methods》：Optimization and comparative study of SARS-CoV-2 RNA extraction principles for enhanced viral RNA yield in wastewater samples

本文针对废水监测中SARS-CoV-2 RNA提取效率低、抑制剂干扰等问题，系统比较了四种基于裂解缓冲液和珠磨法的RNA提取试剂盒。研究发现，通过优化样本体积与缓冲液比例，Zymo试剂盒在无需额外抑制剂去除步骤的情况下，可获得最低Cq值（平均30.65）和最高BCoV回收率（12.91%），且成本最低（$159.5/50次），为大规模废水监测提供了高效、经济的解决方案。

　　

随着COVID-19疫情的持续，废水监测作为一种非侵入式的公共卫生工具，能够早期预警社区疫情暴发。然而，废水中病毒浓度低、成分复杂，存在大量PCR抑制剂，严重影响了SARS-CoV-2 RNA的提取效率和检测灵敏度。目前，虽然已有多种RNA提取技术应用于废水监测，但不同方法的回收率、成本和操作便捷性差异显著，缺乏系统性的比较和优化研究。为此，研究人员开展了一项深入比较研究，旨在找到最适合废水样本的RNA提取方案。

本研究发表在《Journal of Microbiological Methods》上，通过两阶段实验设计，系统评估了四种常用的RNA提取试剂盒。第一阶段优化了两种基于裂解缓冲液的试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit和Zymo Quick RNA Viral Kit）的样本输入体积和缓冲液比例；第二阶段将优化后的方案与两种基于珠磨法的试剂盒（RNeasy Power Water Kit和AllPrep Power Viral DNA/RNA Kit）进行直接比较。研究使用来自美国北卡罗来纳州梅克伦堡县三家污水处理厂的30份进水样本，通过电负性膜过滤（EMF）方法富集病毒，并采用RT-qPCR技术定量SARS-CoV-2 N1基因和过程控制病毒牛冠状病毒（BCoV）。

关键技术方法包括：病毒富集采用电负性膜过滤（EMF）法，通过调节pH至3.5-4并添加MgCl₂提升病毒回收率；RNA提取比较四种商业化试剂盒，重点关注样本体积、缓冲液比例和抑制剂去除步骤的优化；病毒定量使用RT-qPCR，以Cq值和拷贝数/升为评价指标，并通过BCoV回收率评估提取效率；统计分析采用单因素方差分析和配对t检验评估不同方法的显著性差异。

3.1. 标准曲线和检测限

通过连续稀释SARS-CoV-2 RNA标准品建立标准曲线，确定检测限（LOD）为4.6拷贝/反应（Cq 37.88），定量限（LOQ）为12.37拷贝/反应（Cq 36.44）。各提取方法的拷贝/升检测限见附表S3。

3.2. 提取试剂盒优化：第一阶段

修改QIAamp Mini Kit和Zymo Kit的样本体积与缓冲液比例发现，使用全样本体积（800μL）能显著提升RNA产量。QIAamp Mini Kit的选项D（样本:缓冲液:乙醇=800:0:800）Cq值最低（平均32.68），但未达统计显著性（P=0.09）；Zymo Kit的选项C（样本:缓冲液=800:800）Cq值（平均31.29）显著低于厂商推荐方案（P=0.02）。抑制剂去除步骤对QIAamp Mini Kit是必要的，而Zymo Kit无需此步骤即可有效克服抑制。

3.3. BCoV回收率

Phase 1中，Zymo Kit选项C的BCoV回收率最高（11.91%-16.07%），且抑制剂去除步骤反而降低回收率（P<0.05）。Phase 2比较显示，Zymo Kit回收率最高（12.91%），显著优于RNeasy Power Water Kit（2.20%）。

3.4. 提取原理比较：第二阶段

Zymo Kit在Cq值（平均30.65）、拷贝/升和BCoV回收率上均最优，且无需抑制剂去除步骤。QIAamp Mini Kit与AllPrep DNA/RNA Kit性能相近，而RNeasy Power Water Kit因多步离心导致RNA损失严重，表现最差。5倍稀释实验证实所有方法均无显著PCR抑制。

3.5. 提取试剂盒成本与效率比较

Zymo Kit成本最低（159.5/50次），耗时最短（3.5小时处理21样本），且步骤简洁（12步提取+3步预处理）。QIAampMiniKit需额外抑制剂去除成本（128.7），总成本较高（$469.7）。

讨论与结论

本研究通过优化样本体积和缓冲液比例，显著提升了裂解缓冲液类试剂盒的RNA提取效率。Zymo Kit凭借其内置的抑制剂去除能力和成本优势，成为废水监测中最具性价比的选择。尽管磁珠法在其他研究中表现优异，但本研究表明优化后的裂解缓冲液法在手动操作场景下更具实用性。该优化方案为资源有限实验室提供了可靠技术路径，未来可扩展至其他RNA病毒（如流感、诺如病毒）的监测，并可与ddPCR等灵敏检测技术结合，进一步提升公共卫生预警能力。