基于天然低共熔溶剂的尿酸氧化酶稳定性与催化效率提升研究：多尺度实验与模拟策略

《Journal of Molecular Liquids》：Improving the stability and catalytic efficiency of urate oxidase with natural deep eutectic solvents: Integrated in vitro and in silico approaches

本研究通过天然低共熔溶剂（DES）显著提升黄曲霉尿酸氧化酶（UOX）的热稳定性（Tm↑）与催化效率（Kcat↑），结合荧光光谱与分子动力学模拟揭示DES诱导酶结构紧缩的分子机制，为酶制剂工业化应用提供新策略。

　　

亮点

本研究创新性地采用由海藻糖、甘油和氯化胆碱构成的天然低共熔溶剂（DES）处理尿酸氧化酶（UOX），通过多尺度实验与模拟验证其显著提升酶热稳定性（T_m↑）与催化效率（K_cat↑）的分子机制。

材料

实验所用试剂包括8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、硼酸、尿酸（≥99%纯度）等购自Sigma-Aldrich；碘化钾、氯化胆碱、海藻糖（≥99%纯度）等由Merck提供；Ni-NTA亲和层析树脂购自Qiagen。

荧光测量

近年来荧光光谱技术的灵敏度、空间分辨率和稳健性显著提升。本研究使用Cary Eclipse荧光光谱仪对比分析DES处理前后UOX的稳态荧光变化，通过碘化钾荧光淬灭实验、ANS结合实验及内源荧光检测，发现DES使酶结构更紧凑并维持天然构象。

分子动力学模拟

基于尿酸氧化酶晶体结构（PDB ID: 5FRC），采用GROMACS 2024软件包与CHARMM27力场进行分子动力学模拟。DES组分的拓扑参数通过SwissParam生成，体系经最速下降法能量优化后，分析RMSF（均方根涨落）、RMSD（均方根偏差）、SASA（溶剂可及表面积）、RG（回转半径）等参数，证实DES处理使酶整体能量降低、结构更稳定。

酶制备

实验采用携带pET-28a质粒的重组大肠杆菌（BL21/DE3），通过卡那霉素抗性筛选阳性克隆（图1A）。酶纯化采用镍离子亲和层析技术，最终获得高纯度UOX用于后续实验。

结论

DES-TCG处理显著增强UOX的热稳定性和催化性能。DSC和FTIR验证了DES的共晶特性，荧光与分子动力学模拟一致表明DES通过诱导酶结构紧缩提升稳定性，为工业酶制剂开发提供新思路。