乳铁蛋白调控溶血曼氏杆菌外膜囊泡蛋白质组及其致病性减弱机制研究

《Journal of Radiology Nursing》：Differences between protein cargo in outer membrane vesicles released from Mannheimia haemolytica A2 in the presence and absence of bovine lactoferrin

本研究针对反刍动物肺炎曼氏杆菌病（PM）防治难题，探讨了牛乳铁蛋白（LF）对病原菌Mannheimia haemolytica外膜囊泡（OMVs）蛋白质组成的影响。研究发现LF胁迫导致OMVs释放数量增加、粒径增大，并下调162种蛋白表达，包括OmpA、Lpps等关键毒力因子，为开发基于OMVs的新型PM防治策略提供了理论依据。

　　

在反刍动物养殖业中，肺炎曼氏杆菌病（Pneumonic Mannheimiosis, PM）是一种造成重大经济损失的呼吸道传染病。其主要病原体——溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）——的耐药性问题日益严峻，而现有商业疫苗的保护效果却不尽如人意，这使得寻找新的治疗策略变得尤为迫切。在人与动物的先天免疫系统中，乳铁蛋白（Lactoferrin, LF）作为一种重要的糖蛋白，早已被证实具有抑制甚至杀灭细菌的潜力。有趣的是，革兰氏阴性菌（如溶血曼氏杆菌）在生长过程中会持续向外释放一种名为外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs）的纳米级颗粒。这些囊泡犹如细菌的“特洛伊木马”，包裹着多种细菌成分，在感染过程中既能帮助细菌逃逸宿主免疫攻击，又能递送毒力因子损伤宿主细胞。更为关键的是，OMVs的组成并非一成不变，会随着细菌所处环境（例如是否面临抗生素或免疫因子胁迫）而发生动态变化。那么，一个引人入胜的科学问题便产生了：如果利用乳铁蛋白这种天然的免疫分子去“刺激”溶血曼氏杆菌，其所释放的OMVs会发生怎样的改变？这些改变是否能让原本助纣为虐的OMVs“改邪归正”，甚至为开发新型防控手段带来契机？

为了回答上述问题，由Christian Avalos-Gómez、Mario Alejandro Aguilar-Chaparro、Emmanuel Ríos-Castro、Ernesto Marin-Flamand、Ana Elvia Sánchez-Mendoza和Mireya de la Garza组成的研究团队，在墨西哥城高级研究中心（Cinvestav）细胞生物学系开展了一项深入研究。该研究旨在系统分析在有无牛乳铁蛋白（bLF）的培养条件下，溶血曼氏杆菌A2菌株所释放OMVs的蛋白质 cargo（货物）差异，并评估这种差异对OMVs潜在致病性的影响。相关成果为对抗PM提供了新的思路。

本研究采用的关键技术方法主要包括：在有无bLF条件下培养M. haemolytica A2并提取其OMVs；利用纳米颗粒跟踪分析等技术对OMVs进行粒径和浓度表征；最后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对OMVs进行全面的蛋白质组学定性及定量分析。

研究结果

蛋白质组学鉴定揭示OMVs的复杂组成

通过高通量蛋白质组学分析，研究人员从M. haemolytica A2的OMVs中总共鉴定出766种蛋白质。这些蛋白来源广泛，不仅包括预期中的外膜蛋白（Outer Membrane Proteins, OMPs）和细胞包膜蛋白，还发现了相当数量的胞质蛋白，其中大部分蛋白质的功能与细菌的各类代谢过程密切相关。这一发现证实了OMVs能够包裹并运载多样化的细菌成分。

乳铁蛋白诱导OMVs蛋白质 cargo 的显著重编程

对比分析显示，bLF的加入对OMVs的蛋白质组成产生了深远影响，共有162种蛋白质的表达水平发生了差异性调节。这些变化影响了多个重要的细菌生理通路，包括基础代谢、氨酰-tRNA（aminoacyl-tRNA）生物合成、RNA降解以及次级代谢产物的生物合成。这表明LF给细菌造成了显著的应激压力，迫使细菌调整其OMVs的“货物清单”。

关键毒力相关蛋白的丰度下降

在LF存在下，最值得关注的发现是多个与病原性密切相关的蛋白在OMVs中的含量显著降低。这包括数种脂蛋白（Lipoproteins, Lpps）和外膜蛋白，特别是作为乳铁蛋白结合蛋白的OmpA（外膜蛋白A）。此外，与细菌外膜稳定性和致病性相关的Tol–Pal系统的两个组分也出现了下降。这些蛋白的减少可能直接导致OMVs的致病性减弱。

乳铁蛋白影响OMVs的物理特性

除了蛋白质组成的改变，研究还观察到bLF处理似乎倾向于使细菌释放出更多数量的OMVs，且这些囊泡的尺寸也有所增大。这种物理特性的变化可能与细菌在应激状态下加速囊泡生成以排出有害物质或传递应激信号有关。

研究结论与意义

本研究得出结论，牛乳铁蛋白能够作为一种有效的应激源，改变溶血曼氏杆菌外膜囊泡（OMVs）的生物学特性。这种改变体现在两个层面：一是物理层面，即OMVs的产量和尺寸增加；二是分子层面，即其蛋白质 cargo 发生重编程，尤其表现为多种毒力因子（如OmpA、Lpps等）的装载减少。这些由LF修饰的OMVs，其蛋白质组成的改变暗示着它们对宿主细胞的直接损伤能力可能下降。

该研究的重大意义在于，它首次系统地揭示了乳铁蛋白如何通过调控致病菌OMVs的组成来潜在削弱其毒性。这为理解天然免疫分子与细菌囊泡之间的相互作用提供了新的视角。更重要的是，这些经过LF“改造”的OMVs，由于其毒力成分减少，有可能被开发成一种安全的“类疫苗”平台，即作为抗原递送系统或本身作为减毒疫苗，为预防和治疗肺炎曼氏杆菌病（PM）提供一种全新的、应对抗生素耐药性问题的替代性策略。