基于覆盆子状金银钯纳米球双向驱动纳米抗体的免疫层析试纸条用于黄曲霉毒素B1的灵敏检测

《LWT》：Novel Raspberry-like AuAgPd Nanospheres Bidirectional Driven Nanobody-based Immunochromatographic Strip for Sensitive Detection of Aflatoxin B 1

本研究针对传统胶体金免疫层析试纸条（ICTS）在黄曲霉毒素B1（AFB1）现场检测中准确性不足的问题，开发了一种基于内滤效应（IFE）的双信号（荧光-比色）免疫传感器。研究团队合成了覆盆子状三金属金银钯纳米球（RTNPs）作为聚集量子微球（AQMs）的高效猝灭剂，并以纳米抗体G8作为识别元件。该传感器可在10分钟内实现AFB1的双模式检测，检测限分别达到10.2 pg/mL（荧光）和14.9 pg/mL（比色），灵敏度较传统方法显著提升。在实际玉米样本加标回收实验中表现出良好的准确性与精密度，为食品安全现场快速检测提供了有力工具。

　　

在食品安全领域，黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁, AFB₁）作为一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，因其强烈的肝毒性和基因毒性而备受关注。这种霉菌毒素经常污染在不当条件下储存的谷物、坚果和油料作物，被国际癌症研究机构（IARC）列为第1类致癌物。目前，欧盟规定玉米中AFB₁的最高限量为5 μg/kg，而中国规定玉米及其制品中的限量为20 μg/kg。鉴于AFB₁的毒性特点和各国限标，开发快速、灵敏的现场检测方法迫在眉睫。

传统检测技术如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）虽精度高，但仪器成本高、流程耗时且需要专业人员操作，限制了其广泛应用。与之相比，免疫层析试纸条（Immunochromatographic Test Strips, ICTS）以其操作简单、成本低、便于携带和快速出结果等优点，成为现场检测的有力替代方案。

然而，传统竞争法格式的ICTS针对小分子检测通常采用单一的“信号关闭”（Turn-off）模式，即高浓度的目标物会抑制检测线（T线）信号的产生，导致信号强度与目标物浓度呈负相关，这在一定程度上限制了检测灵敏度。为了突破这一局限，研究人员开始尝试通过荧光猝灭策略实现小分子的“信号开启”（Turn-on）双模式ICTS检测。

在此背景下，河南工业大学食品科学与技术学院的研究团队在《LWT》期刊上发表了一项创新性研究，开发了一种基于纳米抗体的双信号输出免疫层析传感器。该研究巧妙地利用了内滤效应（Inner Filter Effect, IFE），克服了F?rster共振能量转移（FRET）对距离严格要求的限制，为AFB₁的快速、高灵敏检测提供了新思路。

为开展本研究，研究人员主要应用了几项关键技术：首先，成功合成并表征了具有覆盆子状结构的金银钯三金属纳米球（RTNPs），将其作为高效的荧光猝灭剂和比色探针；其次，表达并纯化了特异性识别AFB₁的纳米抗体G8，用以替代传统的单克隆抗体作为识别元件；再者，制备了橙色荧光聚集量子微球（AQMs）作为荧光供体，并将其与AFB₁-牛血清白蛋白（BSA）复合物固定于检测线；最后，组装了双信号读出的免疫层析试纸条平台，并系统优化了探针制备、检测线包被浓度、样品缓冲液等关键条件，最终建立了荧光“信号开启”和比色“信号关闭”的双模式检测体系。

3.1. 覆盆子状金银钯纳米球（RTNPs）和聚集量子微球（AQMs）的表征

通过透射电子显微镜（TEM）观察证实，AQMs呈均匀球形，直径约150纳米，其大尺寸和高比表面积有利于在检测线上的稳定固定。合成的金纳米粒子（AuNPs）、薄壳和厚壳AuAgPd均呈现球形貌，溶液颜色从红色变为黑色且随壳层增厚而加深。元素Mapping和X射线光电子能谱（XPS）分析验证了AuAgPd的核壳结构，其中Au位于核心，Ag和Pd均匀分布在表面。紫外-可见光谱显示，厚壳AuAgPd-2纳米粒子的吸收光谱与AQMs的发射光谱重叠度最高，预示着其具有最优的猝灭效率。粒径分布分析表明，AuNPs的平均直径为30.71纳米，在表面生长Ag和Pd后逐渐增加至45.06纳米。

3.2. 荧光猝灭的比较与原理分析

通过将不同浓度的AuNPs、薄壳和厚壳AuAgPd与等体积AQMs溶液混合，发现厚壳AuAgPd引起的荧光强度降低最为显著，其猝灭效率比AuNPs和薄壳AuAgPd分别提高了1.21倍和1.09倍。通过测量平均荧光寿命（τave）和Zeta电位，研究发现加入AuAgPd后AQMs的τave没有显著变化，且AQMs、AuNPs和AuAgPd均带负电荷，产生排斥力使得供体-猝灭剂距离难以缩小到10纳米以内。这些结果证实荧光猝灭机制主要是由AuAgPd对AQMs激发光和发射光的吸收所引起的内滤效应（IFE），而非依赖于近距离能量转移的FRET。通过调节AuNPs表面的壳层厚度可以改变溶液折射率和颜色，从而增强AuAgPd的紫外-可见吸收光谱与AQMs发射波长的光谱重叠，显著提高荧光猝灭效率。

3.3. AuAgPd偶联效率评估

通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法评估纳米抗体G8在AuAgPd和AuNPs上的偶联效率。结果显示，AuAgPd的偶联效率在98.43%至99.15%之间，与AuNPs的偶联效率（98.52%至99.63%）相当，证明RTNPs在保持AuNPs优异抗体结合能力的同时，具有更优的猝灭效率和比色性能。AuAgPd与G8偶联后，Zeta电位从-28.1 mV变为-32.5 mV，进一步证实了AuAgPd@G8的成功偶联。

3.4. AuAgPd@G8-AQMs-ICTS检测条件的优化结果

对免疫探针制备过程中的pH值、纳米材料用量、抗体用量和重悬体积等参数进行了优化，最终确定最佳条件为pH 6、材料体积100 μL、G8体积2 μL、重悬体积40 μL。检测线AFB₁-BSA的最佳包被浓度为0.2 mg/mL。样品缓冲液中聚乙烯吡咯烷酮K30（PVPK30）的最佳浓度为3 g/100 mL，该条件能保证样品流动速度适中，确保探针与人工抗原充分结合。

3.5. AuAgPd@G8-AQMs-ICTS性能评估

在最优条件下，对AuAgPd@G8-AQMs-ICTS（实验组）和AuNPs@G8-AQMs-ICTS（对照组）的检测性能进行了评估。实验组在荧光模式下的检测限（LOD）为10.2 pg/mL，线性范围为0.021–1.838 ng/mL；在比色模式下的LOD为14.9 pg/mL，线性范围为0.069–46.294 ng/mL。与对照组相比，实验组的荧光模式灵敏度提高了3倍，比色模式灵敏度提高了9.5倍。与已报道的AFB₁检测方法相比，本研究首次将RTNPs作为猝灭材料应用于ICTS，获得了更低的检测限，并通过双信号输出提高了检测准确性，同时利用纳米抗体降低了成本。特异性实验表明，该传感器对AFB₁具有高特异性，与黄曲霉毒素M₁（AFM₁）、赭曲霉毒素A（OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和T-2毒素等常见真菌毒素无交叉反应。甲醇耐受性实验证明，该方法在10%至70%的甲醇浓度范围内均能保持稳定的检测性能。在玉米样本的加标回收实验中，荧光模式和比色模式的回收率分别在95.5%–103.1%和98.6%–104.6%之间，相对标准偏差（RSD）均低于7%，显示了良好的准确度和精密度。对高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）认证的质控玉米粉样本进行检测，回收率结果进一步验证了该方法在实际复杂基质中检测的可靠性和高精度。

本研究成功建立了一种新型双读出信号ICTS，用于玉米样品中AFB₁残留的灵敏检测。该传感器以橙色荧光AQMs为荧光供体，RTNPs为猝灭剂，并首次将RTNPs引入ICTS平台，证实了AuAgPd与AQMs之间存在内滤效应。利用IFE介导的荧光猝灭，实现了通过荧光“信号开启”和比色“信号关闭”双读出模式对AFB₁进行定量检测。所达到的检测限显著低于传统AuNPs材料，且在真实样本检测中表现出优异的准确性、精密度和特异性。该方法不仅为AFB₁的现场快速检测提供了性能优异的工具，其研究策略也为食品中其他霉菌毒素的检测提供了有价值的参考，对提升食品安全监测水平具有重要的实际应用价值。