基于DNA宏条形码技术解析地中海与大西洋岛屿产雪卡毒素冈比亚藻（Gambierdiscus）与福氏藻（Fukuyoa）的生物多样性及空间分布格局

《Marine Environmental Research》：Biodiversity and spatial distribution of potentially ciguatera-causing dinoflagellates using DNA metabarcoding

本研究针对雪卡毒素中毒（CP）风险日益向温带海域扩散的问题，采用D1-D2 LSU rDNA宏条形码技术，首次系统调查了西地中海巴利阿里群岛与东北大西洋加那利群岛底栖微真核生物群落。研究发现巴利阿里群岛以低毒性的Gambierdiscus australes为绝对优势种，而加那利群岛则富含高毒性物种G. excentricus与G. silvae；首次在加那利群岛检出Fukuyoa ruetzleri，并在两地发现潜在新种Gambierdiscus sp. ‘occultus’。研究揭示了种内rRNA基因变异复杂性，证实了宏条形码技术在监测有害藻华及寄生虫互作中的强大潜力，为雪卡毒素风险评估提供了关键科学依据。

　　

雪卡毒素中毒（Ciguatera Poisoning, CP）是一种因食用被雪卡毒素（Ciguatoxins, CTXs）污染的海产品引起的食源性疾病，全球每年影响数万人。这种毒素源自底栖甲藻属冈比亚藻（Gambierdiscus）和福氏藻（Fukuyoa），它们通常附着在珊瑚礁藻类或沉积物表面。尽管CP传统上被认为是热带地区的地方病，但近年来在亚热带甚至温带海域的报道逐渐增多，包括西班牙的加那利群岛（东北大西洋）和地中海区域。特别是在巴利阿里群岛（西地中海），虽然多年监测中发现了潜在的产毒物种，但至今未有确诊病例记录。由于不同物种甚至不同菌株的毒素产量差异巨大，准确鉴别物种成为风险评估的关键。然而，这些物种形态高度相似，光学显微镜下难以区分，必须依赖分子方法进行精准鉴定。

在此背景下，研究人员选择西班牙的巴利阿里群岛和加那利群岛的格兰加那利岛作为研究区域，采用DNA宏条形码技术（针对LSU rDNA的D1-D2区域），首次系统性地调查了这两个群岛的底栖微真核生物群落，重点聚焦于冈比亚藻和福氏藻的多样性、分布及其生态关联。该研究论文发表在《Marine Environmental Research》上。

为开展本研究，团队于2020年10月在巴利阿里群岛的四个主岛（马略卡岛、梅诺卡岛、伊比萨岛和福门特拉岛）的24个站点进行了空间调查采样，并于2021年在格兰加那利岛的两个站点（Risco Verde和Sardina Norte）及马略卡岛的一个站点（Camp de Mar）进行了时间序列采样。样本采集自0-3米水深的多种基质，包括大型藻类、海草（Posidonia oceanica）叶片和根状茎、岩石刮取物和沙子。样品经乙醇固定后，使用DNeasy Power Soil kit提取总DNA。采用针对D1-D2 LSU rDNA区域的引物（D1R和305R）进行PCR扩增，构建测序文库，并在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。产生的测序数据使用DADA2流程进行处理，以生成扩增子序列变异（ASVs）。ASVs的物种分类通过BLAST与NCBI GenBank数据库进行比对来完成。研究还使用了包含已知物种的模拟群落（Mock Communities）来评估方法的定量性能和观察种内遗传变异。数据分析包括群落结构的PERMANOVA检验、系统发育分析（使用MAFFT比对和RAxML建树）、以及单倍型网络分析（使用TCS方法）等生物信息学方法。

3.1. 底栖群落中的主要真核生物类群

测序共获得14,299,172条 reads，对应16,250个独特ASVs。分析聚焦于最丰富的6000个ASVs。在所有岛屿和站点中，甲藻在 reads 和 ASVs 数量上均占主导地位（通常 >60%），其群落组成在各岛屿间相似。真菌和褐藻纲（ochrophytes）也占有相当比例。

3.2. 甲藻群落组成与分布

宏条形码揭示了高度多样化的底栖甲藻群落。在所有岛屿和站点中，冈比亚藻（Gambierdiscus）、奥斯特藻（Ostreopsis）和共生甲藻科（Symbiodiniaceae）的 reads 比例合计超过 50%。巴利阿里群岛中的福门特拉岛奥斯特藻比例较低。对马略卡岛的空间（2020年10月）和时间（不同季节）调查显示，不同站点和时间的甲藻群落存在显著差异。夏季（7-8月），Suessiales（Suessiaceae和Symbiodiniaceae）占主导，冈比亚藻比例下降，而奥斯特藻 reads 缺失。梅诺卡岛和伊比萨岛2020年与2021年10月的群落也存在显著差异。格兰加那利岛的时间调查未显示明显的季节性模式。对不同基质的分析表明，岩石刮取物和波喜荡草（Posidonia oceanica）样本中经常含有高比例的冈比亚藻和奥斯特藻 reads，沉积物样本则显示出更高且更均匀的多样性。

3.3. 冈比亚藻和福氏藻的多样性与分布

冈比亚藻存在于除3个以外的所有141个样本中。在巴利阿里群岛，G. australes 在 reads 上始终是优势种（如果不是唯一被检测到的）。此外，还检测到少量的 G. excentricus、G. carolinianus 和 Fukuyoa paulensis。在格兰加那利岛，冈比亚藻-福氏藻群落更为多样化。G. australes、G. excentricus 和 G. silvae 的 reads 都很丰富，在许多样本中，高毒性的 G. excentricus 和 G. silvae 的 reads 合计超过了毒性较低的 G. australes。在少数样本中还检测到少量 F. ruetzleri reads。研究未检测到 G. belizeanus、G. caribaeus 等其他已知物种。

3.4. 冈比亚藻潜在新种

研究发现了一个异常的ASV（ASV_1458），与已知冈比亚藻和福氏藻物种的相似性低（~76.4%），代表一个潜在的新种，被非正式地称为“occultus”。该ASV在巴利阿里群岛的三个岛屿（梅诺卡、伊比萨、福门特拉）和格兰加那利岛均有少量检测。系统发育分析和遗传距离计算均支持其为一个独立的新谱系。通过PebbleScout搜索，还在澳大利亚新南威尔士州的一个宏基因组数据集（SRX5609543）中发现了与该ASV完全匹配的序列，扩展了其已知分布范围。

3.5. 种内变异

通过模拟群落分析，发现在单个培养菌株（如 G. australes、F. paulensis、G. excentricus）内存在多个不同的ASVs，证实了甲藻rRNA操作子存在广泛的种内（细胞内）遗传变异。这些变异包括单核苷酸多态性（SNPs）、小缺失甚至大片段缺失和倒位。单倍型网络显示出以主要ASV（通常与Sanger测序参考序列匹配）为中心呈星爆状分布的变异模式。不同ASV的相对丰度在样本间存在共变现象，提示这些变异模式或可用于种群研究。

3.6. 检测到的其他甲藻和原生生物物种

研究还检测到多种其他底栖甲藻，包括其他已知的产毒或有害物种，如 Alexandrium ostenfeldii、Amphidinium carterae、Azadinium spp.、Coolia spp.、Ostreopsis cf. ovata ribotype A、Prorocentrum lima 和 Vulcanodinium rugosum。共生甲藻科（Symbiodiniaceae）非常丰富。寄生性的Syndiniales（如 Amoebophrya、Euduboscquella、Syndinium）也较常见，其中一些形成了不包含已知物种的独立分支。此外，还检测到丰富的其他原生生物，包括多种帕金虫（perkinsids，如 Dinovorax、Parvilucifera），它们在部分样本中 reads 比例很高。

本研究通过D1-D2 LSU rDNA宏条形码技术，成功揭示了巴利阿里群岛和加那利群岛底栖微真核生物群落，特别是冈比亚藻和福氏藻的多样性和分布模式。关键结论在于：首先，两个群岛的物种组成和风险特征显著不同，巴利阿里群岛以低毒性的G. australes为主，这可能是该地区尚未报道CP病例的原因之一；而加那利群岛则富含高毒性的G. excentricus和G. silvae，与当地已报道的CP病例相符。其次，研究首次在加那利群岛记录了Fukuyoa ruetzleri，并在巴利阿里群岛记录了G. carolinianus，扩展了这些物种的已知分布范围。最重要的是，发现并初步描述了一个潜在的冈比亚藻新种“Gambierdiscus sp. ‘occultus’”，其遗传特征与所有已知物种显著不同，可能在多个地理区域有分布。

研究深入探讨了甲藻rRNA基因的种内变异问题，证实了宏条形码数据中许多ASV实为同一物种基因组内的不同拷贝，这对准确评估物种多样性提出了挑战，但也为研究种群遗传结构提供了新的视角。此外，研究还揭示了群落中存在的多种有害甲藻物种和潜在的寄生虫（如Perkinsids），强调了这些生物相互作用可能在调节冈比亚藻种群动态中扮演重要角色。

综上所述，该研究证明了LSU rDNA宏条形码是一种强大且灵敏的工具，可用于监测和研究底栖有害藻类群落，尤其是在常规形态学方法难以应对的物种鉴定和多样性评估方面。研究成果为理解雪卡毒素产毒藻的生态分布、种群动态以及潜在风险提供了关键的基础数据，对未来建立有效的CP预警监测体系具有重要的科学意义和实践指导价值。