3D打印PVDF-TrFE-CPS压电复合骨支架的理化性能与生物相容性研究

《Materials & Design》：Physicochemical properties and biocompatibility of 3D printed PVDF-TrFE-CPS composite bone scaffolds with piezoelectric properties

本研究针对复杂骨缺损修复的临床挑战，开发了一种结合可降解聚（偏氟乙烯-三氟乙烯）（PVDF-TrFE）与硅酸钙（CPS）的3D打印复合支架。该支架在水化7天后表现出7.6–8.38 MPa的压缩强度和6.01 pC/N的压电系数（d33），优于天然松质骨，并具备增强的矿化能力、促进成骨细胞增殖（102.7–107.6%）和碱性磷酸酶活性，降解过程中pH稳定，为骨再生提供了有利的微环境，为个性化骨修复提供了新策略。

　　

骨骼作为人体的支撑结构，其健康至关重要。然而，当遭遇严重创伤、肿瘤切除或先天性疾病时，常会形成大块骨缺损。这类缺损由于结构复杂且个体差异大，一直是临床医生面临的棘手难题。传统的修复方法，如自体骨移植（从患者自身其他部位取骨）或异体骨移植（使用他人捐献的骨），都存在明显局限：自体骨来源有限，且会造成二次创伤；而异体骨则可能引发免疫排斥反应。金属植入物虽然能提供机械支撑，但其弹性模量远高于天然骨，易导致“应力遮挡”效应，即植入物承担了大部分力学负荷，使得周围骨骼因缺乏必要的力学刺激而逐渐萎缩，反而不利于骨愈合。因此，开发能够模拟天然骨特性、并促进自身骨组织再生的新型修复材料，成为骨组织工程领域的研究热点。

天然骨组织本身就是一个“智能”材料，它不仅具有优异的力学性能，还能在受力时产生微弱的生物电信号（即压电效应），这种电信号在骨的生长、重塑和修复过程中扮演着关键角色。它能够激活细胞膜上的电压门控钙离子通道，促进钙离子内流和ATP（三磷酸腺苷）合成，进而调控细胞骨架重排和下游信号通路，最终促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化。因此，能够模拟这种天然骨微电环境的压电材料，被认为是骨修复材料的理想候选者。

在众多压电材料中，聚偏氟乙烯（PVDF）及其共聚物因其良好的压电性、生物相容性和可加工性而备受关注。然而，传统的PVDF材料存在一个致命缺点：其在生物体内难以降解，这限制了其在需要被新生骨组织逐步替代的骨修复场景中的应用。此外，PVDF材料中具有压电活性的β晶相的诱导过程通常较为繁琐和苛刻。为了克服这些局限，研究人员将目光投向了PVDF的共聚物——聚（偏氟乙烯-三氟乙烯）（PVDF-TrFE）。PVDF-TrFE不仅更容易形成压电β相，表现出更高的压电性能，还具备一定的生物降解能力，前景更为广阔。但单纯的PVDF-TrFE支架在机械强度和生物矿化能力方面仍不足以完全满足骨修复的要求。

另一方面，生物陶瓷材料，如硅酸钙（CPS），在骨组织工程中展现出巨大的成骨潜力。CPS能够在常温下通过水化反应硬化，显著提高材料的机械强度，同时释放出钙离子（Ca²⁺）、磷酸根离子（PO₄^3-）和硅酸根离子（SiO₄^4-），这些离子被证明能够有效促进成骨细胞的增殖和矿化过程。与需要高温烧结的羟基磷灰石（HA）相比，CPS的低温硬化特性大大简化了制备流程。

那么，能否将PVDF-TrFE的压电特性与CPS的成骨活性相结合，取长补短，制造出一种性能更优越的复合骨修复支架呢？同时，再利用近年来飞速发展的3D打印技术，就可以实现针对患者特定缺损形状的个性化定制，精准控制支架的内部结构（如孔隙率、孔径），从而更好地模拟天然骨的复杂结构。这正是发表于《Materials》上的这篇研究所要探索的核心问题。

为了制备并评估这种新型复合支架，研究人员主要运用了几项关键技术。首先是基于直接墨水书写（DIW）的3D打印技术，用于精确成型PVDF-TrFE与CPS复合浆料构成的多孔支架结构。其次，通过流变学测试分析了打印墨水的剪切稀化特性等性能，以确保打印过程的顺利进行和支架结构的稳定性。在支架性能表征方面，研究人员系统测试了其水化后的压缩强度、孔隙率、压电系数（d₃₃），并利用X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）分析了材料的物相组成、化学结构和微观形貌。此外，还通过模拟体液（SBF）浸泡实验评估了支架的体外矿化能力，并在Tris-HCl缓冲液中考察了其降解行为。在生物学评价部分，研究从新生SD大鼠颅骨中分离培养了成骨细胞，通过细胞毒性试验（MTT法）、活/死细胞染色、碱性磷酸酶（ALP）活性检测、实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western Blot）等一系列实验，全面评估了支架提取液对成骨细胞活性、增殖及成骨分化相关基因和蛋白表达的影响。

3.1. 可打印性

研究人员首先对配制好的复合支架墨水进行了流变学测试。结果发现，墨水的粘度随着剪切速率的增加而逐渐降低，表现出典型的“剪切稀化”行为，这非常有利于通过挤压进行3D打印。同时，随着应变的增加，墨水的储能模量（G′）逐渐下降，而损耗模量（G″）上升，表明材料从弹性主导行为向粘性主导行为转变。这些流变特性为支架的3D打印成型奠定了理论基础。通过对比硅胶和三种不同配比（CP2.4, CP2.8, CP3.2）的复合浆料的打印线条，发现复合材料的挤出线条宽度均大于设定值，膨胀系数在1.62至1.75之间。将打印出的矩形支架浸泡在无水乙醇3天和去离子水7天后，其体积相较于原始设计体积缩小了约23%，这为实际应用中确定支架的最终尺寸提供了重要参考。

3.2. 复合骨支架的压缩和压电测试

力学性能是骨支架的核心指标。研究发现，随着在无水乙醇中浸泡时间的延长，支架的压缩强度从1.37 MPa显著提升至最高4.84 MPa，这归因于乙醇替换了浆料中的溶剂（DMF和丙酮），并使结构更加致密。更重要的是，在去离子水中水化时，支架的压缩强度随着水化时间的延长而持续增长。浸泡7天后，CP2.4、CP2.8和CP3.2组的压缩强度分别达到7.6 MPa、7.88 MPa和8.38 MPa，这一强度范围与天然松质骨（7-10 MPa）相当，表明其足以承受生理负荷。与此同时，支架的孔隙率随着水化时间的延长而逐渐下降，CP2.4、CP2.8和CP3.2组从约60%降至41%左右，这与CPS水化生成水化硅酸钙（C-S-H）凝胶填充孔隙以及二次产物形成有关，孔隙率的降低与强度的提升呈现负相关关系。在压电性能方面，支架在无水乙醇浸泡后未检测到压电性，但在去离子水中浸泡后，其压电系数d₃₃随水化时间显著增加。浸泡7天后，CP3.2组的d₃₃达到6.01 pC/N，且7天与9天的数值基本稳定。值得注意的是，天然骨的d₃₃约为0.7 pC/N，本研究制备的支架其压电性能远优于天然骨。

3.3. XRD实验

X射线衍射分析揭示了材料水化过程中的物相变化。随着在去离子水中浸泡时间的延长，硅酸三钙（C₃S）水化产物的衍射峰强度逐渐增强，表明水化反应在不断进行。同时，在20.65°处观察到的PVDF-TrFE的β晶相衍射峰强度也随水化时间增加而增强，说明水化过程促进了压电β相的形成，这与压电性能的提升相符。衍射图谱中还出现了碳酸钙（CaCO₃）的衍射峰，这是由于水化生成的氢氧化钙与水中溶解的二氧化碳反应所致。对比水化7天后不同配比的支架，CP2.4组（CPS含量最低）中未水化的C₃S衍射峰最弱，表明其水化反应相对更完全。

3.4. 降解和矿化

理想的骨支架应能在体内逐步降解，为新生骨组织腾出空间。降解实验表明，PVDF-TrFE-CPS复合支架在28天的降解期内质量损失率逐渐增加，其中CPS含量最高的CP3.2组降解率最高，达到9.31%。在整个降解过程中，浸泡液的pH值保持相对稳定，表明支架降解对微环境的酸碱度影响较小，有利于细胞生存。矿化能力是评价骨支架成骨活性的关键。将支架在模拟体液（SBF）中浸泡7天后，SEM图像显示其表面有颗粒状物质沉积。通过能谱仪（EDS）测量表面的硅钙元素比例（Si/Ca），发现所有实验组在矿化后Si/Ca比均显著下降，尤其是CP3.2组，这表明有富钙的羟基磷灰石（HA）形成，且CPS含量越高，矿化能力越强。

3.5. FTIR分析

傅里叶变换红外光谱分析为水化过程中的化学反应提供了证据。光谱显示，随着水化时间延长，在约1620 cm^-1处归属于C=C伸缩振动的吸收带明显增强，这对应于PVDF-TrFE发生的脱氟反应。同时，在1400–1450 cm^-1范围内与PVDF-TrFE极性β相相关的–CH₂–弯曲振动吸收带也显著增强，再次证实了水化过程促进了β相的形成。这种脱氟反应也是实验中观察到支架颜色变深的原因。

3.6. 生物相容性实验结果

细胞实验是检验材料生物安全性和生物活性的金标准。将成骨细胞培养在不同组别支架的提取液中，倒置显微镜观察显示，细胞形态良好，与正常培养组无显著差异，表明材料无急性毒性。活/死细胞染色结果进一步证实，培养1天和3天后，绝大多数细胞存活（显示绿色荧光），仅极少数细胞死亡（显示红色荧光）。MTT法检测细胞增殖发现，与正常培养组相比，各实验组培养24小时和72小时的成骨细胞增殖率均超过100%，其中CP3.2组在72小时的增殖率达到107.6%，提示该组材料不仅无毒，还能促进细胞增殖。碱性磷酸酶（ALP）活性是成骨细胞早期分化的标志。检测结果显示，CP3.2提取液培养的细胞其ALP活性高于对照组，但无统计学显著性，表明材料对ALP活性无负面影响。基因和蛋白水平的结果更具说服力。实时荧光定量PCR显示，与对照组相比，实验组成骨细胞中多个成骨相关基因（如ALP、OPN、OSX、ON、Col-I、OCN、BMP-2、Runx2）的mRNA表达量均显著上调。蛋白质印迹分析定量结果表明，RUNX2、OSX、ALP和OCN等关键成骨蛋白的表达水平也明显升高，尤其是在支架浓度较高的组别中。这表明PVDF-TrFE-CPS复合支架能够从分子层面激活成骨分化通路，促进成骨细胞成熟和细胞外基质矿化。

综上所述，本研究成功通过3D打印技术制备了PVDF-TrFE-CPS压电复合骨支架，并证实其具有与天然松质骨匹配的力学强度、显著优于天然骨的压电性能、良好的生物相容性、适中的降解速率和稳定的降解环境、以及优异的体外矿化能力和成骨诱导活性。该支架巧妙地结合了PVDF-TrFE的压电特性和CPS的生物活性，并通过3D打印实现了结构的可定制化，为解决复杂骨缺损的个性化修复提供了一个极具潜力的新材料平台。研究的讨论部分进一步指出，水化过程产生的碱性环境不仅驱动了CPS的硬化反应，还促进了PVDF-TrFE中压电β相的形成，并可能通过表面电荷效应加速了离子吸附和羟基磷灰石沉积。同时，支架产生的压电信号很可能模拟了天然骨的生物电微环境，从而协同CPS释放的生物活性离子，共同调控成骨细胞的生物学行为。尽管该支架在体外表现出色，但研究人员也指出，其长期的体内降解行为、骨整合效率以及在真实生理力学环境下的压电效应稳定性等，仍需未来的体内实验进行深入评估。无论如何，这项研究为开发下一代功能化骨修复材料提供了重要的理论依据和实践方向。