综述：生物结晶化：利用天然支架实现稳定的蛋白质晶体配方

《New Biotechnology》：Biocrystallization: harnessing natural scaffolds for stable protein crystal formulations

本综述系统阐述了利用天然结晶支架（如Polyhedrin、Cry、CipA、Inka1-PAK4等）进行细胞内生物结晶（biocrystallization）的最新进展。文章重点介绍了这些支架蛋白通过自组装形成稳定晶体基质，用于功能蛋白（如治疗性蛋白、酶）的封装、保护和可控释放的策略。作者深入探讨了直接遗传融合、模块化共表达及翻译后偶联等设计方法，并分析了当前在货物蛋白兼容性、规模化生产及免疫原性方面面临的挑战。最后，展望了人工智能（AI）辅助设计、环境响应型晶体等未来发展方向，为下一代蛋白质基技术的开发提供了重要见解。

　　

1. 引言

蛋白质结晶的传统角色是作为结构分析的工具，但其应用范围正迅速扩展到功能领域，包括蛋白质固定化、稳定化和递送。随着对稳定、高浓度蛋白质治疗剂的需求日益增长，研究重点已从宏观单晶转向均匀、可扩展且功能化的晶体颗粒制剂。这类制剂具有诸多优势，例如增强的物理化学稳定性、抗降解保护、简化的下游纯化以及可能更低的制造成本，所有这些特性都迎合了工业和临床需求。这一进展的核心在于蛋白质自组装现象及其形成能够将生物活性大分子封装在明确三维结构中的晶体支架的能力。

在活细胞中，通过高局部蛋白质浓度、大分子拥挤和液-液相分离实现的蛋白质自组装或自发结晶，创造了有利于成核的过饱和微环境。然而，给定蛋白质的结晶倾向受其内在特性（如表面熵、构象灵活性和分子内相互作用网络）支配，这些特性常常阻碍成核并阻止有序晶格接触的形成。目前，大量的努力正导向设计能够克服传统晶体形成局限的蛋白质系统，方法包括利用天然自组装、细胞内结晶事件和晶体工程策略。其中一种合成系统利用了天然存在的支架（如杆状病毒多角体蛋白、苏云金芽孢杆菌Cry蛋白、真核生物Inka1-PAK4和细菌CipA蛋白），这些支架在生理条件下能够固有地结晶。当与目标蛋白融合时，这些支架在宿主细胞内引导自发生物结晶，形成有序的、载有货物的晶体颗粒。它们自组装的倾向编码在其一级序列和结构基序中，使得在天然细胞条件下或异源表达后能够形成晶格。这种生物结晶策略有效地绕过了传统稳定蛋白质制剂的许多限制，包括繁琐的纯化步骤、低产量、生产后制剂努力和高生产成本。

2. 结晶支架

2.1. 多角体蛋白（Polyhedrins）

多角体蛋白是在昆虫细胞中杆状病毒感染后期产生的异常稳定的晶体蛋白。大量的多角体蛋白单体自组装包围病毒粒子，形成高度有序的弹性晶体（多角体），保护病毒颗粒免受环境压力。晶体结构显示，尽管形状和大小各异，所有病毒多角体的底层晶体对称性却惊人地相似，晶胞大小约为100埃。在杆状病毒中，晶格形成由域交换的N端H1 α-螺旋启动，该螺旋从三聚体单元延伸至相邻的三聚体，促进形成稳健的四面体簇。这些簇通过二硫键以及盐桥进一步稳定，形成密集堆积且机械弹性的立方晶格，具有I23对称性。

当多角体蛋白通过杆状病毒载体在昆虫细胞中重组表达时，它会形成高度有序的晶体结构，可以通过将目标蛋白与多角体蛋白本身进行遗传融合，或与促进融入生长晶体基质的工程化标签共表达，来工程化封装异源蛋白或多肽。这些重组多角体能够封装功能性蛋白而不损害其生物活性。多角体蛋白系统在治疗应用方面的潜力已通过开发用于再生医学的生长因子负载多角体得到证明。特别创新的适应技术是开发多角体蛋白递送系统（PODS），它允许蛋白酶依赖性控制释放封装蛋白。可扩展性仍然是多角体蛋白递送系统转化为临床或工业应用的关键因素。

2.2. Cry毒素

苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种革兰氏阳性、形成孢子的细菌，以其产生杀虫晶体蛋白（ICPs）而闻名，包括特征明确的Cry毒素。这些蛋白质在孢子形成过程中自组装成伴孢晶体包裹体，通过在易感昆虫的碱性中肠中溶解释放活性毒素而作为生物杀虫剂。由于其特异性和安全性，Bt衍生的生物农药广泛用于农业和害虫防治。在结构上，Cry毒素表现出模块化结构，包含多个结构域，排列成α-螺旋和β-片层丰富的折叠，促进寡聚化和结晶。Cry蛋白通常呈现三结构域架构：结构域I（参与膜插入和孔形成的α-螺旋束）、结构域II（用于受体识别的β-棱柱）和结构域III（有助于结构稳定性的β-三明治）。这些结构域使Cry蛋白能够在细菌细胞内形成紧凑有序的晶体阵列。

Cry蛋白晶体最令人兴奋的应用之一在于其作为药物递送载体。这些晶体主体充当保护性支架，屏蔽敏感蛋白质治疗剂免受降解，允许随时间控制释放，并且可以工程化以靶向特定细胞或组织。晶体形式还便于纯化和无需冷藏的长期储存，这对药物和生物制品尤其有价值。Cry融合系统也被用于固定酶，为工业或环境应用创建稳健且可重复使用的生物催化剂。除了在递送和催化方面的用途，Cry蛋白也是开发新型生物活性化合物的有效工具。

2.3. CipA蛋白

晶体包裹蛋白A（CipA）是一种来自发光光杆状菌（Photorhabdus luminescens）的天然蛋白，已成为细胞内晶体包裹体的强大支架。CipA具有在活细胞内自组装成高度有序的蛋白质晶体包裹体（PCIs）的非凡能力。这些PCIs源于CipA四聚体分层组织成多层晶体晶格，形成致密、规则的结构，既坚固又功能多样。在分子水平上，CipA表现出独特的氨基酸组成，可能有助于其结晶特性。大约42.3%的残基是疏水的，促进了晶体晶格内的紧密堆积和稳定性。特别引人注目的是CipA异常高的甲硫氨酸含量（约13.3%），这可能具有超越疏水性的功能含义。

CipA基PCI固有的结晶性和结构完整性已被利用，通过遗传融合封装外源蛋白。除了简单的货物封装，CipA支架已被应用于固定酶，用于控制多步反应和增强代谢输出。最近的进展进一步扩展了CipA支架的效用。无细胞系统现在允许在活细胞外生产CipA晶体，为可扩展生产和下游工程开辟了途径。因此，CipA作为一个多功能和模块化的生物结晶平台，提供了几个实际优势。

2.4. Inka1-PAK4复合物

Inka1-PAK4复合物代表了一种用于细胞内蛋白质封装和功能化的新颖且多功能的系统。最近的研究表明，丝氨酸/苏氨酸激酶PAK4的催化结构域（PAK4^cat）与其内源性抑制剂Inka1共表达，可在哺乳动物细胞中诱导棒状晶体的自发形成。结构分析揭示了具有纵向通道（直径约80埃）的六方晶格，能够容纳客体蛋白如绿色荧光蛋白（GFP）。这一结构特性使得能够开发具有可定制功能的工程化蛋白质晶体。

除了磁性功能化，iBox-PAK4^cat平台可用于生理条件下的分子相互作用和其他细胞内测定。这种方法能够实时评估活细胞内的结合事件。通过瞬时DNA转染生产iBox-PAK4^cat晶体的简单性，加上其高度的客体分子兼容性，使其成为多种应用的强大平台。尽管有这些有前景的应用，iBox-PAK4^cat晶体的更广泛潜力仍未得到充分探索。

3. 生物结晶的设计策略

货物晶体形成的成功取决于融合构建体的合理设计。有效的晶体结构域融合需要系统评估融合伙伴的方向、接头组成和表达策略。柔性接头可以促进独立结构域折叠，而刚性接头则有利于晶体晶格形成的空间排列。结合生物信息学工具和结构引导建模提高了设计精度，并最大化了生物技术、结构和治疗应用中的功能封装。

3.1. 直接遗传融合

直接遗传融合仍然是构建杂化晶体材料最简单的策略。这种方法涉及将晶体支架和目标蛋白的编码序列连接成一个单一的开放阅读框，产生一个串联多肽链。然而，融合的方向（货物是连接在N端还是C端）可以深刻影响折叠、生物结晶效率和功能输出。为了克服这些限制，肽接头通常被插入结构域之间。理想的接头设计平衡了几个因素，包括长度、二级结构倾向、氨基酸组成、疏水性和蛋白酶抗性。

3.2. 模块化融合用于共表达系统

在共表达系统中，模块化设计策略对于维持功能和支撑有效的晶体组装至关重要。多角体蛋白结构分析确定了对于晶体晶格形成必需的标签和最小支架。将外源蛋白与这些短片段融合通常需要与野生型多角体蛋白共表达，后者充当支架种子。类似地，Inka1与PAK4共表达形成棒状细胞内晶体。这些发现强调了模块化设计的重要性，包括最小支架的使用、融合方向、接头优化和支架共表达。

3.3. 翻译后偶联策略

遗传融合的替代方案是翻译后偶联，即蛋白质在表达后通过化学或酶法组装。这种模块化方法绕过了克隆限制，允许每个组分在最佳宿主系统中独立生产。化学偶联使用双功能交联剂在反应性侧链之间形成共价键。酶连接提供了位点特异性和更温和的替代方案。模块化相互作用标签，如SpyTag/SpyCatcher、亲和素-生物素系统和StrepTag，能够以高特异性实现共价或可逆的蛋白-支架耦合。

翻译后组装在多组分系统中特别有价值，其中遗传融合可能损害表达、折叠或结晶性。将位点特异性连接与优化表达系统相结合，能够创建具有增强结构完整性和生物性能的模块化、功能性蛋白质晶体。

3.4. 人工智能引导设计

尽管是一个相对较新且认知度较低的领域，人工智能领域正在广泛发展并迅速对蛋白质设计和预测产生重大影响。通过提供融合蛋白的一级氨基酸序列，可以使用各种AI软件来生成高度精确的三维模型。除了结构预测，新方法可以生成具有所需特性的全新序列。

尽管有这些进步，挑战仍然存在。当前的AI模型提供静态结构快照，没有考虑构象变化、动力学或与其他细胞因素的相互作用，这些常常影响蛋白质功能和稳定性。此外，鉴于这些方法的新颖性，实验验证对于确认真实世界结晶和制剂研究中的预测仍然至关重要。总体而言，虽然存在局限性，将AI整合到蛋白质工程中具有加速生物结晶和制剂开发的强大潜力。

4. 当前挑战与未来方向

尽管生物结晶支架的前景日益广阔，但要实现其全部潜力，仍需解决一些技术和转化挑战。

首先，货物蛋白的大小和折叠兼容性仍然是关键的制约因素。大尺寸或错误折叠的货物会破坏晶体晶格形成，导致封装效率低、稳定性降低或生物活性丧失。为了缓解这些问题，新兴策略包括合理设计具有扩展晶格通道和增强结构弹性的支架变体。生产后方法，如位点特异性化学或酶促偶联，也越来越受欢迎，用于将大型或敏感货物纳入预形成的晶体晶格而不破坏其天然结构。

其次，对于许多支架系统而言，在哺乳动物细胞中的异源表达效率仍然低下，这为人类治疗药物的转化努力带来了复杂性。改进的共表达系统正在开发中，用于哺乳动物细胞中复杂的多亚基蛋白质组装体的高效蛋白质表达。此外，微流控结晶平台和无细胞合成系统的整合正在实现更可控和可扩展的生产。

第三，免疫原性对临床使用构成障碍，特别是在使用来自细菌或病毒来源的支架时。尽管有报道称多角体蛋白和Cry蛋白等支架显示出低免疫原性，但缺乏全面的研究。必须对重组蛋白质晶体进行系统的免疫原性分析，以识别和减轻免疫风险。经过验证的策略，如表位去除、蛋白质人源化、PEG化和糖工程化，可以适用于晶体配方，以在保持功能的同时增强生物相容性。

第四，可扩展性和下游处理需要进一步创新。遗传构建体必须允许受控的晶体生长、可控的颗粒大小以及与大规模纯化方法的兼容性。可扩展策略使得能够高效生产适用于口服药物递送和配方的合成生物活性晶体。

展望未来，几个有前景的方向正在浮现，可能极大地扩展支架辅助生物结晶在生物医学和生物技术应用中的效用和复杂性。一个特别令人兴奋的途径涉及将环境响应元件整合到晶体结构中。例如，引入pH敏感接头、氧化还原活性二硫键或光裂解基团，可以使晶体能够响应特定的生理信号而可控地解体或激活。另一个强大的方法涉及用靶向配体、抗体、肽或适体对蛋白质晶体进行表面功能化。通过用细胞或组织特异性分子修饰晶体表面，可以设计出表现出增强归巢能力和选择性细胞摄取能力的递送系统。

5. 结论

本综述强调了支架辅助生物结晶的变革潜力，这是一个处于晶体工程、合成生物学和生物制造交叉点的领域。通过利用天然存在的结晶结构域，可以在活细胞或无细胞系统中诱导蛋白质自组装成有序的功能性晶体基质。这些支架，经过进化具有稳定性和结构精确性，提供了一条独特的途径来克服传统工业规模蛋白质纯化和晶体配方中长期存在的挑战。将功能性蛋白与这些支架进行遗传融合的能力，使得能够实现可编程的细胞内生物结晶，并具有增强的可重复性、对不稳定生物分子的保护以及靶向递送的潜力。

货物包装的成功关键取决于支架蛋白的选择，这些蛋白具有固有的自组装特性，能够形成有序的晶体晶格。每个支架系统提供独特的结构优势。然而，一些研究挑战仍然存在。货物大小限制、折叠干扰和晶格兼容性可能阻碍复杂或大型蛋白质的掺入。此外，在哺乳动物系统中的高效表达仍然是一个障碍，特别是在临床转化方面。此外，确保均匀的晶体尺寸、控制成核动力学以及实现大规模的下游纯化仍然是关键的工程目标。

为了克服这些限制，未来的研究必须优先考虑合理的支架设计、接头优化以及刺激响应元件的整合，以实现结晶货物的可控释放或激活。计算蛋白质设计、AI驱动建模和无细胞合成平台方面的进步将加速具有改进功能和转化可行性的下一代晶体系统的开发。尽管如此，支架辅助货物生物结晶系统在创建稳定、可编程且对生物信号响应的精密生物材料方面具有特殊前景，为蛋白质配方和部署提供了前所未有的控制。随着合成生物学、结构设计和生物工程工具的不断发展，这种方法有潜力成为可扩展制造和稳定配方策略的一个组成部分。