独活寄生汤通过抑制eEF2K介导的细胞衰老缓解绝经后类风湿关节炎

《Pharmacological Research》：Duhuo Jisheng Decoction mitigates postmenopausal rheumatoid arthritis by suppressing eEF2K-mediated cellular senescence

本研究针对绝经后类风湿关节炎(PM-RA)炎症和骨破坏更严重的临床难题，发现真核延伸因子2激酶(eEF2K)在老年RA患者外周血单核细胞中显著高表达。研究人员通过构建卵巢切除(OVX)增强的佐剂性关节炎(AIA)模型，证实独活寄生汤(DHJSD)能够下调eEF2K表达，改善细胞周期阻滞，抑制衰老相关分泌表型(SASP)，从而有效缓解关节炎症和骨侵蚀。该研究首次揭示DHJSD作为新型eEF2K抑制剂在PM-RA治疗中的重要作用，为靶向衰老通路治疗关节炎提供了新策略。

　　

在全球范围内，类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)呈现出明显的性别差异，女性患病率是男性的2-3倍。在中国，这种差异更为突出，男女比例达到1:4，超过500万人受此疾病困扰。特别值得注意的是，55%的女性RA患者在55岁后被确诊，绝经后女性表现出更高的RA发病和进展风险。与未绝经的RA患者相比，绝经后RA(Postmenopausal RA, PM-RA)具有疾病活动度加剧、骨侵蚀加速和生活质量下降等特征，成为临床治疗的重点和难点。

尽管PM-RA具有独特的病理生理特征，当前的治疗方案仍不够理想，迫切需要基于疾病特异性机制的靶向干预措施。近年来，生物学衰老被认为是RA发病的关键因素，每年加速衰老与疾病风险增加1%-3%相关。细胞衰老——以不可逆的细胞周期停滞和衰老相关分泌表型(Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP)为特征——已成为RA进展的关键驱动因素。

在这项发表于《Pharmacological Research》的研究中，研究人员从临床问题出发，发现真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor-2 kinase, eEF2K)在≥60岁RA患者的外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)中表达显著高于≤40岁和40-60岁患者群体。这一发现提示eEF2K可能与PM-RA的发病机制密切相关。

为了验证这一假设，研究团队构建了OVX增强的AIA大鼠模型，模拟人类PM-RA的病理特征。通过分子、免疫学和组织病理学分析，结合体外细胞模型，系统评估了独活寄生汤(Duhuo Jisheng Decoction, DHJSD)的治疗效果及其作用机制。

主要技术方法包括：临床样本分析（33例女性RA患者PBMCs）、动物模型建立（SD雌性大鼠OVX+AIA模型）、细胞实验（LPS刺激的RAW 264.7细胞和RANKL诱导的破骨细胞）、分子生物学技术（Western blot、qPCR、ELISA）、影像学分析（Micro-CT）以及细胞周期和衰老检测等。

3.1. eEF2K表达与女性RA患者年龄和疾病严重程度相关

研究人员首先检测了不同年龄段女性RA患者PBMCs中eEF2K的mRNA表达水平。结果显示，在女性RA患者中，eEF2K在PBMCs中的表达随年龄增长而增加，绝经后患者（≥60岁）的表达显著高于≤40岁和40-60岁年龄段。此外，血清类风湿因子(Rheumatoid Factor, RF)水平也随患者年龄增长而升高。

体外实验中，使用eEF2K抑制剂NH125处理LPS刺激的RAW 264.7细胞和RANKL诱导的破骨细胞，发现NH125能显著抑制促炎细胞因子的释放和破骨细胞生成，这与减轻细胞周期阻滞和抑制SASP相关。抑制eEF2K还能降低P53、P16和P21的表达，改善细胞周期停滞状态，逆转细胞衰老。

3.2. DHJSD治疗显著改善绝经后AIA模型大鼠的关节炎进展和骨破坏

研究团队建立了绝经后AIA大鼠模型，并每天给予DHJSD治疗，连续24天。结果显示，DHJSD（5.78 g/kg）能显著减轻AIA+OVX大鼠的体重下降，剂量依赖性地抑制足爪肿胀，效果与甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)相当甚至更优。

Micro-CT成像显示，DHJSD能显著改善AIA+OVX大鼠的皮质/骨小梁骨丢失，组织病理学分析表明DHJSD减轻了滑膜增生、炎症浸润和关节间隙狭窄。此外，DHJSD还剂量依赖性地抑制了关节炎诱导的促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和破骨细胞生成标志物（NFATC1、CTSK）的表达上调。

3.3. DHJSD治疗调节eEF2K介导的细胞周期和细胞衰老

与对照组相比，AIA+OVX大鼠PBMCs和骨组织中eEF2K表达显著升高。MTX或DHJSD治疗能显著降低PBMCs和骨组织中eEF2K的表达。DHJSD还能显著降低PBMCs和骨组织中P53、P21和P16的mRNA水平，以及骨组织中Cyclin B1蛋白水平。

流式细胞术分析显示，DHJSD治疗逆转了AIA+OVX大鼠PBMCs在G2/M期的细胞周期阻滞。这些结果表明，DHJSD可能通过调节eEF2K影响细胞衰老和细胞周期，从而改善炎症反应和减轻骨破坏。

3.4. 体外实验验证含DHJSD血清对细胞衰老、炎症和骨破坏的抑制作用

分子对接分析发现，eEF2K能与ginsenoside Rg1/ginsenoside Rb1/liquiritin通过氢键高亲和力结合。实验表明，含DHJSD血清能降低RANKL诱导的破骨细胞和LPS刺激的RAW 264.7细胞中eEF2K、P53、P16、P21和Cyclin B1的表达。

含DHJSD血清还能逆转细胞周期阻滞，显著降低SA-β-Gal（细胞衰老标志物）的荧光强度。此外，10%含DHJSD血清能降低LPS刺激的RAW 264.7细胞中细胞炎症因子的产生，以及破骨细胞骨破坏相关基因（CTSK、NFATC1、TRAP、MMP-9和MMP-13）的表达。

3.5. DHJSD通过靶向eEF2K在绝经后AIA动物模型中增强抗关节炎疗效

研究发现，DHJSD能逆转AIA+OVX大鼠的体重下降，显著减轻足爪水肿和关节炎评分，但对AIA大鼠没有显著影响。组织学和Micro-CT分析显示，AIA+OVX+DHJSD大鼠的骨骼病理变化少于AIA+DHJSD大鼠。

AIA+OVX大鼠骨组织中eEF2K表达显著高于AIA大鼠，且与细胞周期相关基因（P53、P21、P16和Cyclin B1）表达呈正相关。DHJSD治疗能显著降低AIA+OVX大鼠骨组织中eEF2K表达，以及细胞周期相关基因和衰老相关基因的水平。

3.6. DHJSD通过靶向eEF2K和调节细胞周期延缓细胞衰老

将含DHJSD血清（10%）与eEF2K抑制剂NH125（0.5 μM）联合使用，发现联合治疗能更显著地降低LPS刺激的RAW 264.7细胞中eEF2K表达水平，同时更显著地下调TNF-α、P53和P16表达。

构建eEF2K过表达mRNA并转染至LPS刺激的RAW 264.7细胞和RANKL诱导的破骨细胞，发现eEF2K过表达细胞的衰老相关蛋白和基因（P53、P21和P16）表达显著高于阴性对照细胞。含DHJSD血清能降低这些指标的表达。

研究结论表明，DHJSD通过抑制eEF2K表达，减轻细胞周期阻滞，从而改善细胞衰老，有效缓解炎症和骨破坏。该研究首次将DHJSD定位为新型eEF2K抑制剂，为PM-RA的靶向治疗提供了理论依据。

在讨论部分，研究人员强调PM-RA患者预后往往较差，原因是严重的关节炎症和骨质疏松同时存在。尽管抗风湿药物和生物制剂的发展为RA治疗带来了希望，但其副作用仍是需要解决的重要挑战。本研究首次报道了60岁以上RA患者PBMCs中eEF2K mRNA表达的显著上调，并成功建立了绝经后AIA动物模型。

该研究的创新点在于首次将DHJSD的抗关节炎作用与eEF2K抑制联系起来，揭示了其在调节细胞周期和延缓细胞衰老方面的新机制。与传统的抗风湿药物相比，DHJSD显示出更好的安全性，对肝肾功能指标无显著影响。

然而，研究也存在一定局限性，如实验主要在RAW 264.7细胞和破骨细胞系以及AIA动物模型中进行，需要在其他细胞和动物模型中进行验证以确立更广泛的适用性。此外，基于分子对接预测的结合能力，最具潜力的候选成分ginsenoside Rg1/Rb1和liquiritin对eEF2K的抑制作用值得进一步研究。

总之，这项研究填补了PM-RA发病机制分子机理与DHJSD治疗机制之间的空白，为eEF2K靶向干预的转化应用和DHJSD在PM-RA治疗中的临床推广奠定了基础。该研究不仅为理解PM-RA的分子机制提供了新视角，也为开发针对衰老通路的创新治疗策略提供了重要依据。