三种表层水采样方法对环境DNA宏条形码技术检测鱼类物种的比较研究

《Regional Studies in Marine Science》：Fish species detection by environmental DNA metabarcoding by three surface sampling methods

本研究针对环境DNA（eDNA）宏条形码技术中不同采样方法可能影响物种检测结果的问题，系统比较了船舱底部进水口（4.5米）、桶采样（0米）和尼斯金瓶（5/10米）三种表层水采样方法。通过对日本周边海域99个站点的分析发现，三种方法在物种丰富度估计上高度一致，但特定物种（如秋刀鱼和日本竹荚鱼）的相对读长丰度存在方法特异性差异。研究表明船舱进水口采样可作为自动化监测的有效工具，为海洋生物多样性研究提供了重要方法学支撑。

　　

在广阔的海洋中，准确监测鱼类多样性对理解生态系统功能和实施保护措施至关重要。传统方法如拖网捕捞不仅耗时耗力，还可能对生物造成伤害。近年来，环境DNA（environmental DNA，eDNA）技术应运而生，通过检测水体中生物脱落的DNA片段来评估物种存在情况，成为一种非侵入性的生物监测工具。特别是eDNA宏条形码（metabarcoding）技术，利用通用引物扩增并高通量测序混合DNA样本，能够一次性检测整个鱼类群落。然而，这种技术的有效性高度依赖于水样采集方法，不同采样方式可能导致结果差异，尤其是在开阔大洋中，eDNA浓度低、分布不均，使得方法选择尤为关键。

目前，海洋eDNA研究主要使用尼斯金瓶（Niskin bottle）和桶采样（bucket sampling）两种方式。尼斯金瓶可精确采集特定深度的水样，但需要研究船停泊作业，限制了观测范围；桶采样虽然操作简单，但仅能获取表层水样。相比之下，船舱底部进水口（ship-bottom intake）采样能够在不中断航行的情况下连续采集水样，具有明显的 logistical 优势，但其检测效率与传统方法的可比性尚不明确。

为解决这一问题，由东京大学大气海洋研究所Sk Istiaque Ahmed领导的研究团队在《Regional Studies in Marine Science》上发表了最新研究成果，系统比较了上述三种表层水采样方法在鱼类eDNA检测中的表现。研究人员在7个航次中采集了99个站点的样本，使用MiFish引物进行eDNA宏条形码分析，评估了各方法在物种检测效率、相对读长丰度（Relative Read Abundance，RRA）等方面的差异。

研究采用的主要技术方法包括：三种表层水采样技术（船舱进水口、桶采样、尼斯金瓶）；环境DNA提取与纯化标准流程；MiFish引物宏条形码技术；Illumina平台高通量测序；生物信息学分析流程（包括DADA2去噪、QIIME 2质量过滤和ASV推断）；以及广义线性混合模型（GLMM）和广义加性模型（GAM）等统计分析方法。样本来源于日本周边海域的99个站点，涵盖黑潮、亲潮、混合水域和对马暖流等多个海洋区域。

3.1. 物种组成 among methods

eDNA宏条形码分析共检测到321种鱼类，隶属134科。其中181种为三种方法共同检测到，显示出高度重叠的物种组成。主要检测科包括灯笼鱼科（Myctophidae）、虾虎鱼科（Gobiidae）和鲹科（Carangidae）等。频繁检测到的物种包括秋刀鱼（Cololabis saira）、日本鳀（Engraulis japonicus）和日本竹荚鱼（Trachurus japonicus）等。这些发现表明，尽管采样深度不同（0-10米），但三种方法在物种检测方面具有较高一致性。

3.2. 不同方法间的物种丰富度

通过泊松广义线性混合模型（GLMM）分析发现，三种方法估计的物种丰富度无显著差异。相反，水温是影响物种丰富度的主要因素，在温度较高的外海区域检测到更多物种。模型还显示，在中等温度（约19°C）时，近海和远海的物种数量差异较小。这些结果说明，环境因素而非采样方法是影响物种丰富度估计的主要因素。

3.3. RRA比较

尽管物种检测一致性高，但某些物种的相对读长丰度（RRA）存在方法间差异。在181种共同检测到的物种中，仅24种显示RRA显著差异。特别值得注意的是，秋刀鱼和日本竹荚鱼在桶采样中表现出更高的RRA。通过相关分析发现，15种频繁检测物种中有9种在桶采样和进水口采样间存在显著正相关，表明多数物种的RRA在不同方法间具有一致性。

3.4. 桶采样与进水口采样RRA相关性

对99个站点的分析显示，大多数物种在两种方法间的RRA无显著差异。然而，6个物种表现出检测偏差：秋刀鱼、日本竹荚鱼、五条鰤（Seriola quinqueradiata）和日本刺鲳（Hyperoglyphe japonica）在桶采样中RRA更高，而穆氏暗光鱼（Maurolicus muelleri）和大鳞突吻鱼（Tribolodon hakonensis）则在进水口采样中表现更好。

3.5. GAM模型对环境影响的检测偏差分析

通过广义加性模型（GAM）分析了环境因素对物种检测偏差的影响。日本竹荚鱼的检测偏差与温度和盐度显著相关，在高温高盐的黑潮水域更易在桶采样中检测到。五条鰤的偏差则与叶绿素a浓度和盐度有关，在亲潮影响的低盐高叶绿素区域更易被桶采样检测。这些结果表明，物种特异性偏差主要受环境因素驱动的鱼类垂直分布影响，而非方法本身。

研究的讨论部分深入分析了产生这些结果的可能机制。物种检测的高度一致性可能源于研究区域的充分混合的表层（0-10米），使得eDNA在垂直方向上分布均匀。此外，10升的过滤水量可能足以捕获大多数常见物种的eDNA。对于出现偏差的物种，如秋刀鱼，其更好的桶采样检测效率可能与该物种的表层分布特性有关，或者其eDNA可能因浮力作用而上浮至海面。日本竹荚鱼的偏差则可能与其幼体和卵的表层分布相关，这些早期生命阶段更易被桶采样捕获。

该研究的重要意义在于证实了船舱进水口采样作为自动化监测工具的可行性。虽然某些物种存在检测偏差，但大多数物种的表现一致性支持将进水口采样用于大范围海洋生物多样性监测。特别是考虑到其连续采样能力，这种方法有望整合到商船等现有平台，实现低成本、大范围的海洋监测网络。

研究也指出了若干局限性。采样深度的固有差异（桶采样0米、进水口4.5米、尼斯金瓶5-10米）可能影响结果，未来研究应在相同深度比较不同方法。此外，eDNA在海洋中的行为特性，如降解、运输和垂直分布，仍需进一步研究。对特定物种的检测偏差，建议结合物种特异性qPCR方法进行验证和校正。

总之，这项研究为海洋eDNA监测提供了重要的方法学指导。三种采样方法在大多数情况下可互换使用，但研究者应根据目标物种的生态特性和研究目的选择适当方法。船舱进水口采样因其操作便利性和连续性，特别适合大尺度、长期监测项目，有望推动海洋生物多样性研究进入新的发展阶段。