三维皮肤模型在微核试验与彗星试验中的应用评估：提升基因毒性测试的生理相关性

《Toxicology Letters》：Investigating the application of 3D skin models in Micronucleus assay and Comet assay

本文系统评估了三维（3D）重建人类皮肤模型（EpiSkin-MNT与T-Skin）在微核试验（MNT）和彗星试验中的应用，证实其相较于传统二维（2D）细胞培养具有更优的生理相关性、可重复性及预测性能。通过参考化学品测试，结合DNA修复抑制剂aphidicolin（APC）增强检测敏感性，为替代动物实验、符合监管趋势的基因毒性评估提供了可靠平台（OECD 487）。

　　

试剂与测试化学品

所有化学品均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市），除非另有说明。无钙镁Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）购自Gibco（美国纽约州格兰德岛）。低熔点琼脂糖购自Lonza（中国广州），SYBR Gold核酸凝胶染料购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市）。用作DNA修复抑制剂的阿非迪霉素（APC）购自J&K（美国加利福尼亚州圣何塞市）。所有其他试剂均为分析纯。

微核试验

微核试验根据OECD测试指南487（OECD, 2020）进行。体外微核测试已进行广泛的回顾性验证（Corvi et al., 2008）。每个处理组使用三个重复的EpiSkin-MNT组织。测试物质（见表1）溶解于丙酮中并进行局部涂抹（每次应用15 μL，在72小时内应用三次）。根据初步细胞毒性结果选择六个浓度，目标是相对于溶剂对照，细胞存活率（RI）分别为0%、10±10%、20±10%、40±10%、60±10%和80±10%。在最后一次处理后，将组织消化以分离细胞，将细胞悬液滴在载玻片上，并用Diff-Quik染色。每个重复计数1000个双核细胞中的微核频率。阳性对照（丝裂霉素C，MMC）和阴性对照（丙酮）与每次运行同时进行。结果以千分比（‰）表示。

细胞毒性评估

通过比较处理组织与溶剂对照中双核细胞的百分比（如上所述的RI）来确定细胞毒性（图4）。使用ATP和腺苷酸激酶（AK）测定评估细胞毒性，以确定彗星试验中每种测试物质的最大非细胞毒性浓度。导致ATP减少超过50%或AK增加250%的剂量被排除在随后的基因毒性分析之外（Frei et al., 2020, Mathes et al., 2014）（图5）。所有测定均进行三次独立实验。

讨论

本研究证明，将微核试验（MNT）和彗星试验与3D重建人类皮肤模型相结合，为基因毒性评估提供了一个强大、可重复且具有生理相关性的平台。两种测定均显示阳性对照（例如MMC、VB、5-FU、2-AAF、MMS、BaP、PHB）的基因毒性终点出现明显的剂量依赖性增加，而阴性对照（甘露醇、d-柠檬烯、PG）则保持在历史对照范围内。这些发现与先前使用3D皮肤模型进行基因毒性测试的研究一致（Aardema et al., 2010; Reus et al., 2013）。在彗星试验中使用DNA修复抑制剂阿非迪霉素（APC）增强了DNA损伤检测的敏感性，这与Pfuhler等人（2020）的报道一致。我们的研究结果支持3D皮肤模型在监管基因毒性测试中更广泛应用的潜力，符合3R原则（减少、优化、替代动物实验）和全球协调努力（Rogiers et al., 2018）。